《Brain Sciences》：Neuroinflammatory Response to Postnatal Administration of Valproic Acid in Wistar Rats as a Mechanism for the Development of Autism Spectrum Disorders: The Role of Neutrophils
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背景/目的：根据当前概念，神经炎症是自闭症谱系障碍（ASD）发展的可能原因之一。然而，中性粒细胞在神经炎症中的作用仍研究不足。研究人员旨在通过对Wistar大鼠早期出生后给予丙戊酸（VPA）后生理和行为障碍及炎症反应的比较分析，确定中性粒细胞在ASD发展的神经
背景/目的：根据当前概念，神经炎症是自闭症谱系障碍（ASD）发展的可能原因之一。然而，中性粒细胞在神经炎症中的作用仍研究不足。研究人员旨在通过对Wistar大鼠早期出生后给予丙戊酸（VPA）后生理和行为障碍及炎症反应的比较分析，确定中性粒细胞在ASD发展的神经炎症机制中的作用。方法：研究在38只雌雄大鼠幼崽上进行，其中一半从出生后第6天（PND）到第12天腹腔注射VPA水溶液，剂量为150 mg/kg；对照组大鼠接受水。使用标准生理和行为测试：体重监测、第25 PND的痛觉敏感性（热板测试）和第55 PND的社会行为（同胞/非同胞测试）。分光光度法测定血清和小脑匀浆中中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）和α1-蛋白酶抑制剂（α1-PI）的活性。通过在大鼠血清存在下梨形四膜虫（Tetrahymena pyriformis）纤毛虫的死亡率分析补体系统（CS）活性。结果：Wistar大鼠早期出生后给予VPA诱导了ASD特征性的生理和行为变化，证实了所用实验模型的有效性。这些变化伴随着大鼠血清中炎症因子（CS、α1-PI、NE）活性升高，表明炎症发展。VPA处理增加了小脑中的NE活性，这可能表明中性粒细胞浸润大脑和神经炎症发展。结论：获得的数据表明中性粒细胞在ASD发展的神经炎症机制中的作用。
**论文解读：中性粒细胞在丙戊酸诱导的Wistar大鼠自闭症谱系障碍模型神经炎症机制中的作用**
**研究背景与问题**
自闭症谱系障碍（ASD）是一组以社交沟通障碍、兴趣狭窄和刻板行为为核心特征的神经发育性疾病，其发病率在过去数十年间显著上升（从每万人4-5例增至50-116例），且男性患病率高于女性，但近年研究提示这一差异可能部分源于诊断偏差。目前ASD的发病机制尚未统一，尽管遗传因素被广泛关注，但确切基因尚未明确。研究者认为，神经炎症是ASD发展的潜在原因之一，免疫组化研究已发现ASD患者大脑中多种细胞因子表达异常，外周血和脑脊液中促炎因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6）水平升高，补体系统（CS）和急性期蛋白活性改变。然而，中性粒细胞在神经炎症中的具体角色仍缺乏系统研究。中性粒细胞作为先天免疫的主要效应细胞，其分泌的弹性蛋白酶（NE）是炎症标志物，但NE是否通过浸润中枢神经系统（CNS）参与ASD的神经炎症机制尚不清楚。为此，研究人员利用丙戊酸（VPA）诱导的ASD动物模型，通过比较分析生理行为变化与炎症因子活性，旨在阐明中性粒细胞在ASD神经炎症机制中的作用。
**研究内容与结论**
该研究对38只Wistar大鼠幼崽（雌雄各半）进行早期出生后VPA给药（150 mg/kg，从出生后第6至12天，PND6-12），对照组注射等量水。通过体重监测、热板实验（第25 PND）和社会行为测试（第55 PND）评估生理和行为表型；同时测量血清和小脑匀浆中NE、α1-蛋白酶抑制剂（α1-PI）活性以及CS功能活性（以梨形四膜虫死亡速率衡量）。结果显示，VPA处理组大鼠出现体重增长减慢、痛觉阈值升高（热板潜伏期延长）以及社会行为异常（潜伏期延长、社交新颖性系数降低、理毛行为减少），这些变化与ASD临床特征一致，验证了模型的有效性。在炎症因子方面，VPA组血清中CS活性升高（纤毛虫半衰期缩短）、α1-PI和NE活性显著增加，表明外周炎症反应。值得注意的是，小脑匀浆中NE活性在VPA组显著升高，而α1-PI活性无差异，提示中性粒细胞可能浸润大脑并导致神经炎症。相关性分析显示，在对照组中，血清CS、NE与α1-PI活性与社会行为指标存在正相关，而小脑NE活性与社会行为呈负相关；VPA处理破坏了这些神经免疫交互联系。此外，热板潜伏期与血清CS活性在对照组中呈负相关，与血清α1-PI活性呈正相关，而与小脑NE活性的相关性在VPA处理后发生反转，进一步支持痛觉敏感性改变与神经炎症的关联。
**重要意义**
该研究发表在《Brain Sciences》上，首次从功能活性角度系统揭示了中性粒细胞在VPA诱导的ASD模型神经炎症机制中的作用。研究结果提示，早期出生后VPA暴露可导致大鼠出现ASD样行为，并伴随外周和中枢炎症反应，其中小脑NE活性升高可能间接反映中性粒细胞浸润和神经炎症，为理解ASD的免疫学发病机制提供了新视角。这一发现与研究人员先前在ASD儿童中观察到的血清NE活性升高的临床结果一致，但NE是否可作为神经炎症的潜在生物标志物仍需进一步验证。
**主要关键技术方法**
1. **动物模型与样本来源**：使用38只Wistar大鼠幼崽（来自俄罗斯Stolbovaya饲养场），随机分为VPA组（10♂10♀）和对照组（8♂10♀），VPA组从PND6-12每日腹腔注射150 mg/kg VPA水溶液，对照组注射等量水。
2. **生理与行为测试**：体重监测（PND6-21）、热板实验（PND25，55℃热板测定后爪舔舐潜伏期）、社会行为测试（PND55，T型迷宫，记录潜伏期、接近次数、接触时间及社交新颖性系数）。
3. **生化检测**：分光光度法测定血清和小脑匀浆中NE活性（底物N-t-BOC-Ala-p-NP水解速率）、α1-PI活性（抑制胰蛋白酶BAEE酯酶活性）、CS功能活性（梨形四膜虫死亡速率测定）。
4. **统计分析**：使用Shapiro-Wilk检验正态性，Student's t检验或Mann-Whitney检验比较组间差异，Spearman秩相关分析相关性，Benjamini-Hochberg校正多重比较。
**研究结果**
**3.1 VPA对幼鼠生理发育的影响**
通过体重监测发现，VPA组在PND12、14、15、16体重低于对照组，且PND6-12和PND14-21期间体重增长显著减慢（p分别为0.0042和0.0335），符合ASD模型生理特征。热板实验显示，VPA组后爪舔舐潜伏期延长（p=0.038），表明痛觉敏感性降低，与ASD临床特征一致。
**3.2 VPA对动物社会行为的影响**
社会行为测试中，VPA组起始隔间潜伏期（p=0.0016）和接近同胞/非同胞的潜伏期（p=0.029和p<0.001）均显著延长，社交新颖性系数降低（p=0.03），表明社交偏好受损。此外，VPA组理毛行为（总理毛、中央方格和非同胞区域）显著减少（p分别为0.024、0.003和0.016），提示情感状态改变。
**3.3 VPA对血清和小脑炎症因子活性的影响**
VPA组血清CS功能活性升高（纤毛虫半衰期缩短，p<0.05），α1-PI活性（p<0.05）和NE活性（p<0.01）显著增加，表明外周炎症。小脑中NE活性在VPA组高于对照组（p=0.048），而α1-PI活性无差异。相关性分析显示，对照组中血清CS活性与热板潜伏期负相关（R=-0.6），α1-PI活性与热板潜伏期正相关（R=+0.4）；VPA处理后，小脑NE活性与热板潜伏期由正相关（R=+0.8）转为负相关（R=-0.6），提示神经炎症参与痛觉调节。此外，对照组中社会行为指标与血清CS、NE、α1-PI活性呈正相关，与小脑NE活性呈负相关；VPA处理后这些相关性消失，表明神经免疫交互作用被破坏。
**讨论与结论总结**
讨论部分指出，VPA的早期出生后给药通过损伤未成熟大脑（抗氧化防御不足）并可能诱导中性粒细胞浸润，导致长期行为缺陷。小脑NE活性升高可能源于中性粒细胞穿过血脑屏障（BBB）浸润，或局部脑源性丝氨酸蛋白酶（如BSP1）的贡献，但需进一步研究证实。α1-PI作为NE的主要生理抑制剂，在血清中活性升高具有抗炎作用，但在小脑中未升高，可能削弱其神经保护功能。补体系统（CS）在正常生理中介导突触修剪和神经可塑性，但VPA诱导的CS激活可能促进异常修剪和外周免疫细胞招募。对照组中免疫因子与社会行为的正相关反映正常免疫系统对社交行为的调节作用，而VPA后相关性的缺失表明炎症破坏了这种调控。
**研究结论**（翻译原文结论部分）：
早期出生后给予Wistar大鼠丙戊酸（VPA）诱导了自闭症谱系障碍（ASD）特征性的生理（晚期新生儿发育中体重增长减慢和痛觉敏感性降低）和行为（前成年期社交行为受损）变化，证实了所用实验模型的有效性。这些变化伴随着大鼠血清中炎症因子（补体系统、α1-蛋白酶抑制剂（α1-PI）、中性粒细胞弹性蛋白酶（NE））活性升高，表明对VPA给药产生的炎症反应。NE活性升高不仅出现在血清中，也出现在暴露于VPA的大鼠小脑中，这可能间接表明神经炎症的发展。由于NE是活化中性粒细胞的主要标志物，小脑中NE活性的增加可暂时性解释为中性粒细胞浸润大脑或血脑屏障（BBB）破坏的后果。基于这一假设，提出了中性粒细胞在ASD发展的中枢炎症机制中具有重要作用的假说。显然，需要进一步的实验研究来证实这一假说。所呈现的结果与先前在严重ASD儿童中观察到的血清NE活性升高的临床研究一致。然而，血清NE是否可被视为ASD中神经炎症的潜在标志物仍需要进一步研究。大鼠小脑中NE活性的来源以及所用实验模型中是否存在中性粒细胞浸润大脑或BBB破坏也需要进一步研究。
