用于检测尸检人脑组织中双酚类及邻苯二甲酸酯代谢物的定量方法的验证

《Analytica Chimica Acta》：Validation of a method for quantification of bisphenols and phthalate metabolites in post-mortem human brain tissue

　　

摘要：

塑料的成本效益和多功能性使其无处不在，导致人们大量接触到与塑料相关的化学物质，如邻苯二甲酸盐和双酚类。虽然这些化学物质与多种不良健康影响有关，包括激素失调和神经行为问题，但它们进入大脑的生物利用度仍不明确。因此，测定脑组织中的这些化学物质对于评估血脑屏障的通透性以及为动物研究提供支持至关重要。

为了解决这一问题，研究人员开发了一种新方法，通过改进的QuEChERS提取法结合己烷净化处理去除脂质，再利用LC-MS/MS技术对14种邻苯二甲酸酯代谢物和7种双酚类进行定量分析。该方法的检测限对于邻苯二甲酸酯代谢物而言为0.02纳克/克至0.8纳克/克脑组织，而双酚类的检测限则在0.02纳克/克至2纳克/克之间。

通过成功测定脑组织中的这些污染物，该方法为评估血脑屏障的通透性、测量大脑中的暴露程度以及为研究塑料相关化学物质的动物实验提供了高度敏感的手段。

引言

塑料是一种合成聚合物材料，从20世纪中叶开始在市场上出现（Chamas等人，2020年；Crawford和Martin，2020年），由于其耐用性、低成本的生产方式以及良好的适应性，已广泛应用于各种消费品中。欧洲塑料行业协会估计，2024年全球塑料产量为430.9百万吨，其中聚丙烯、聚乙烯和聚氯乙烯占据了总产量的半数以上（Plastics Europe，2025年）。

正是由于这些特性，塑料不仅是一种有用的材料，同时也成了主要的环境污染源。绝大多数塑料聚合物类型都具有很强的耐久性，包括一些被标榜为可生物降解的塑料（如聚乳酸），它们在环境中难以分解（Chamas等人，2020年）。此外，塑料在环境中的风化还会产生微塑料和纳米塑料，进一步引发其他环境问题（Lehner等人，2019年；MacLeod等人，2021年）。对于某些塑料，比如聚碳酸酯，其聚合物结构分解后会释放出共聚单体，如双酚类，即使在低浓度下也会对多种生物造成危害。塑料的多功能性部分得益于各种化学添加剂的运用，这些添加剂用于赋予塑料不同的功能特性。增塑剂是塑料中最常见的功能添加剂，主要用于提高塑料的柔韧性和可塑性，在这类添加剂中，邻苯二甲酸酯是最为广泛使用的类别之一（Hahladakis等人，2018年；Wypych，2023年）。

双酚类和邻苯二甲酸盐都与多种不良健康后果相关。虽然已经确定了多种作用机制，比如内分泌干扰和与各种激素受体的相互作用，但具体导致某种健康问题的机制往往仍不清楚（Braun，2017年；Radke等人，2019年；Routti等人，2021年；Scott、Mason和Sharpe，2009年）。同样，接触双酚类物质，尤其是历史上最常见的双酚A，会影响到激素机制，进而影响生育能力、哮喘发病率、出生体重以及神经行为发育的差异（Rochester，2013年；Symeonides等人，2024年；Vandenberg等人，2012年）。尽管邻苯二甲酸酯和双酚类在人体内的消除半衰期通常只有几小时（Koch、Bolt和Angerer，2004年；Koch等人，2012年；Teeguarden等人，2015年；Thayer等人，2015年），但由于持续暴露，通过尿液进行人体生物监测时，常常能检测到多种双酚类和邻苯二甲酸酯代谢物的高频率存在（Calafat、Valentin-Blasini和Ye，2015年；Hartmann等人，2023年；Kasper-Sonnenberg等人，2025年；Katsikantami等人，2016年；Lehmler等人，2018年）。像双酚A这样的双酚类物质会通过结合反应迅速代谢为葡萄糖醛酸结合物（Thayer等人，2015年；V?lkel等人，2002年）。邻苯二甲酸盐同样会在第一阶段代谢过程中迅速转化为单酯类和二次氧化代谢物（Koch、Bolt和Angerer，2004年；Koch等人，2005年；Koch等人，2012年）。虽然关于通过尿液排出的双酚类和邻苯二甲酸酯的数据较为丰富，而在血液和母乳等基质中的数据也有记载，但脑组织中的浓度数据却很少。那些研究这些化合物对大脑影响的动物模型通常并不测定脑组织中的浓度，而是通过观察暴露后的生理或行为变化来进行研究（Ma等人，2025年）。通过尿液分析代谢物来验证暴露剂量也很少见。

鉴于邻苯二甲酸酯和双酚类都与神经行为问题有关，因此有必要从生理层面更深入地了解这些化合物在大脑中的作用，以确定所观察到的神经行为效应是由于直接接触脑组织造成的，还是由于身体其他部位的暴露所引发的间接效应。尽管是在高浓度下，但使用放射性标记的双酚A对大鼠进行的实验表明，双酚A确实存在于神经内分泌器官中（Kim等人，2004年），这进一步凸显了了解其在大脑中浓度的必要性。Geens、Neels和Covaci（2012年）开发了一种方法，通过将双酚A转化为五氟苯甲酰衍生物，从而实现对包括脑组织在内的脂肪生物基质中的双酚A进行定量分析。Charisiadis等人（2018年）则开发了一种基于液液萃取的方法，用于测定脑组织中的双酚A和双酚S。Van der Meer等人（2017年）则采用了Artacho-Cordón等人（2017年）为脂肪组织验证过的方法来测定脑组织中的双酚A。Jeong等人（2019年）则开发了一种LC-MS/MS方法，通过相同的液液萃取技术，针对包括脑组织在内的多种大鼠生物基质中的邻苯二甲酸盐及其单酯代谢物进行定量分析。他们声称，该方法的定量下限为二乙基邻苯二甲酸酯0.04纳克/毫升，单乙基邻苯二甲酸酯为0.1纳克/毫升，这一数值是根据所有基质中最低可检测限的校准值确定的。Ros等人（2016年）则使用分散型固相萃取技术测定了鱼脑中的单(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯和双酚A。只有在添加500纳克/克的较高浓度 spiked样本中才能检测到MEHP，而该方法的检测限估计为双酚A为35纳克/克，MEHP为105纳克/克。在本文中，我们详细介绍了一种基于改进的QuEChERS方法（Anastassiades等人，2003年）并配合己烷净化处理去除脂质的技术，用于测定14种邻苯二甲酸酯代谢物和7种双酚类物质。该方法可用于研究来自生物库等的死后脑样本中的暴露情况及其与神经系统之间的关联，同时也有助于在动物模型研究中进行更为细致的分析。据我们所知，这种经过改进的QuEChERS方法首次被应用于人类脑组织，能够定量分析多种常见的双酚类和邻苯二甲酸酯代谢物。

章节节选

材料与方法

研究团队决定选择邻苯二甲酸酯代谢物作为分析对象，而非其母体化合物。原因在于：首先，邻苯二甲酸酯会迅速代谢为所选择的分析目标物；其次，从实际操作角度来看，分析母体化合物的检测限往往较高，因为它们的背景浓度较高。

结果与讨论

表2展示了该方法的性能指标，包括方法检测限以及经过绝对值校正和相对标准偏差校正后的回收率。通过在加入乙腈之前加入内标物来评估的绝对回收率也相当理想。正如预期的那样，具有最高亲脂性的分析物MiDP的绝对回收率最低，约为15%。其他分子量较高的单酯类以及BP-Z和BP-AP的回收率也相对较低。

结论

本研究提出了一种基于LC-MS/MS的技术，用于测定脑组织中的14种邻苯二甲酸酯代谢物和7种双酚类物质。该方法几乎对所有化合物的检测限都低于0.8纳克/克脑组织。通过对10份人类枕叶的死后样本进行分析，发现有一些化合物的浓度略高于方法检测限，这项初步研究证明了该方法的适用性。不过，对于脂肪组织这类复杂基质中的暴露情况评估

CRediT作者贡献说明

Geoff Eagleham：指导、方法设计、实验研究。Timothy A. Couttas：论文撰写——审阅与编辑、实验研究。Claire E. Shepherd：论文撰写——审阅与编辑、指导、资源协调、项目管理、资金筹集、概念构思。Chun-Yin (Julia) Lin：实验研究。Christos Symeonides：论文撰写——审阅与编辑。Jochen F. Mueller：论文撰写——审阅与编辑、指导、资源协调、项目管理、资金筹集、概念构思。Sarah Dunlop：论文撰写

利益冲突声明

? 作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

作者们要感谢昆士兰大学药学院和药物科学系的Harendra Parekh博士和Rink-Jan Lohman博士，感谢他们为这项研究提供山羊脑组织。

Minderoo中心——塑料与人类健康项目为I.Z.、A.J.、E.A.提供薪资支持，同时也为X.W.提供资助，后者还获得了澳大利亚研究委员会（ARC）的探索型早期职业研究人员奖，项目编号为DE230100466。J.F.M.则获得了ARC的澳大利亚杰出研究员奖学金，项目编号为

Ian Zammit|Ayomi Jayarathne|Emerson Aldridge|Eurwin Suryana|Timothy A. Couttas|Geoff Eagleham|Chun-Yin (Julia) Lin|Claire E. Shepherd|Jochen F. Mueller|Christos Symeonides|Sarah Dunlop|Xianyu Wang

昆士兰环境健康科学联盟（QAEHS），昆士兰大学，伍伦加巴，昆士兰州4102，澳大利亚