《PLOS Pathogens》：Evaluation of intestinal immune responses to Entamoeba dispar using the first domestic clinical isolate in Japan
编辑推荐：
背景：Entamoeba dispar是Entamoeba histolytica的非致病性姊妹种，然而使E. dispar能够在肠道中持续存在而不引起疾病的机制仍知之甚少。用于解析针对E. dispar的肠道免疫应答的实验模型一直有限。在日本和其他东亚国家，
背景：Entamoeba dispar是Entamoeba histolytica的非致病性姊妹种，然而使E. dispar能够在肠道中持续存在而不引起疾病的机制仍知之甚少。用于解析针对E. dispar的肠道免疫应答的实验模型一直有限。在日本和其他东亚国家，E. histolytica感染在男男性行为者中相对常见，而E. dispar感染很少被识别。方法/主要发现：研究人员报告了日本首例国内获得并培养建立的E. dispar感染。从一名无症状HIV阳性患者的粪便囊肿中分离出一株临床菌株NA442，并在与Pseudomonas putida的稳定单菌培养中维持。系统发育和tRNA连锁STR分析确认了物种身份，并揭示了与泰国来源基因型的遗传相似性。利用NA442，研究人员建立了小鼠盲肠感染模型来表征宿主免疫应答。感染诱导了粪便中脂质运载蛋白-2（lipocalin-2）的可检测分泌，提示上皮应激；然而，盲肠组织中的CXCL-1和髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）水平保持在基线水平，未观察到中性粒细胞浸润或组织破坏。NA442在小鼠盲肠中定植长达三周，但仅引起轻微的上皮增厚，没有E. histolytica相关的标志性炎症特征。结论/意义：本研究提供了首个体内证据，表明E. dispar定植尽管在肠道中成功短期持久存在，但仅引发有限的黏膜炎症。NA442作为日本首例国内E. dispar病例的鉴定表明该寄生虫可能在人群中未被注意地传播。NA442菌株为致病性与非致病性Entamoeba物种的比较研究建立了一个有价值的实验工具，并有助于理解肠道毒力和宿主免疫调节的决定因素。
**论文解读：日本首例国内临床分离株Entamoeba dispar NA442的肠道免疫应答研究**
**研究背景与问题**
阿米巴病由粪-口传播的原虫寄生虫溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica）引起，在高收入国家已被视为性传播感染。HIV阳性男男性行为者（MSM）是主要风险群体。然而，东亚国家（包括日本）的流行病学模式与西方国家不同：在日本，MSM主要感染E. histolytica，而在西方国家，该人群更常被非致病性姊妹种迪斯帕内阿米巴（Entamoeba dispar）定植。宿主遗传研究已将瘦素受体Q223R突变与肠道阿米巴病易感性关联，提示中性粒细胞募集在限制E. histolytica肠道定植中的重要性。尽管E. histolytica的小鼠盲肠感染模型于2002年建立并广泛用于解析黏膜免疫应答，但E. dispar的可比肠道感染模型尚未建立。E. histolytica与E. dispar的比较研究强调了水解酶（如半胱氨酸蛋白酶）和黏附分子（如Gal/GalNAc特异性凝集素）在毒力中的重要性，但E. dispar缺乏EhCP-A5表达且Gal/GalNAc-凝集素中间亚基（Igl）表面丰度较低，与其显著降低的致病性相关。尽管有多次尝试，E. dispar在小鼠模型中稳定肠道定植仍难以实现。因此，需要新鲜建立的E. dispar菌株（尤其是无共生或单菌培养菌株）来详细分析肠道定植和宿主免疫应答。
**研究概述与意义**
研究人员报告了日本首例国内获得并培养建立的E. dispar感染，从一名无症状HIV阳性患者的粪便囊肿中分离出临床菌株NA442，并在与恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）的单菌培养中成功维持。系统发育和tRNA连锁短串联重复序列（STR）分析确认了物种身份，并揭示了与泰国来源基因型的遗传相似性。利用NA442，研究人员建立了小鼠盲肠感染模型，发现E. dispar定植诱导了有限的上皮应激反应，但无中性粒细胞浸润或组织破坏，且定植持续长达三周。该研究提供了首个体内证据，表明E. dispar定植尽管成功短期持久存在，但仅引发有限的黏膜炎症。NA442菌株为致病性与非致病性Entamoeba物种的比较研究建立了有价值的实验工具，并有助于理解肠道毒力和宿主免疫调节的决定因素。该论文发表在《PLOS Pathogens》。
**主要关键技术方法**
研究人员从一名HIV阳性男性（无症状，无近期海外旅行史）的粪便样本中分离E. dispar囊肿，经0.05 N HCl处理杀灭伴生菌后，接种于含Crithidia fasciculata的YIMDHA-S培养基中诱导脱囊和培养滋养体。随后采用单菌培养，先以铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作为生长伴生菌，后为动物实验改用无毒性的恶臭假单胞菌（P. putida），并添加丙酮酸钠促进生长。物种鉴定通过18S rRNA基因PCR扩增、Sanger测序和系统发育分析完成，并使用tRNA连锁STR基因分型进行遗传背景分析。肠道感染模型采用C57BL/6NCrSlc小鼠盲肠内接种，通过粪便PCR检测定植动态，使用ELISA检测粪便脂质运载蛋白-2（lipocalin-2）、盲肠组织CXCL-1和髓过氧化物酶（MPO），并通过PAS染色和抗Ly6G免疫组化评估组织病理和中性粒细胞浸润。
**研究结果**
**1. 临床病例报告与E. dispar诊断**
患者为40多岁HIV-1阳性男性，因肺孢子菌肺炎入院，无胃肠道症状。常规粪便检查意外发现Entamoeba囊肿。E. histolytica抗原检测和特异性qPCR均为阴性。显微镜下囊肿直径13.1 ± 0.94 μm，滋养体19.8 ± 1.24 μm，小于E. histolytica。1.8-kb rRNA基因测序显示与E. dispar序列99.78%–99.89%同源性，系统发育分析确认与E. dispar SAW760形成单系群。患者无十年内国际旅行史，表明这是日本首例国内获得性E. dispar感染，菌株命名为NA442。tRNA连锁STR D-A位点基因型与泰国儿童粪便分离株Ed10DA一致，显示遗传相关性。
**2. E. dispar在小鼠盲肠中保留长达三周**
比较E. histolytica和E. dispar NA442（与P. putida共培养）以1×10
5和1×10
6细胞接种C57BL/6NCrSlc小鼠盲肠。体重监测显示，1×10
6 E. histolytica组体重显著下降，而E. dispar组和各对照组的体重变化轨迹相似。大体观察显示，E. dispar组和1×10
5 E. histolytica组盲肠组织形态保存完好，而1×10
6 E. histolytica组出现上皮肿胀和管腔阻塞。粪便PCR检测显示，1×10
6 E. histolytica组70%小鼠在第7天仍阳性，而1×10
5 E. histolytica组全部阴性。1×10
5和1×10
6 E. dispar组第7天阳性率均为60%，与高剂量E. histolytica组相当。长期监测至35天，E. histolytica组第14天70%阳性，第35天50%阳性；而E. dispar组第14天20%阳性，第21天全部转阴，表明NA442在小鼠盲肠中定植长达三周，但无致病特征。
**3. E. dispar感染引起组织增厚但无炎症证据**
粪便脂质运载蛋白-2（lipocalin-2）ELISA检测显示，1×10
6 E. histolytica组感染后前4天水平显著升高，E. dispar组在第1和2天也显著高于假手术对照组，但程度较低，表明两种感染均诱导上皮应激反应。第7天盲肠组织PAS染色显示，E. histolytica组黏膜和黏膜下层厚度显著增加，E. dispar组也出现增厚，与假手术组和P. putida组有统计学差异。但E. dispar组杯状细胞数量未显著增加。CXCL-1（小鼠IL-8同源物，中性粒细胞趋化因子）ELISA显示，仅1×10
6 E. histolytica组显著升高，E. dispar组和1×10
5 E. histolytica组无诱导。髓过氧化物酶（MPO，中性粒细胞浸润标志物）水平仅在1×10
6 E. histolytica组升高，E. dispar组无变化。抗Ly6G免疫组化进一步证实，仅E. histolytica感染小鼠盲肠组织中检测到中性粒细胞浸润，而E. dispar和假手术组无阳性信号。
**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究首次提供了E. dispar肠道免疫应答的体内见解。尽管E. dispar不能进行无共生培养，但与假手术和P. putida对照组比较显示，NA442仅诱导轻微炎症，同时持续至少一周。相比之下，E. histolytica感染导致强烈中性粒细胞募集，这与先前研究一致，可能由NLRP3炎症小体激活、IL-1β释放和NF-κB活化驱动。NA442感染引起上皮增厚和粪便脂质运载蛋白-2适度增加，但无CXCL-1表达，表明激活了替代调节程序而非典型中性粒细胞募集。MPO水平仅在E. histolytica感染组织中升高，进一步支持E. dispar感染中中性粒细胞积累最小。抗炎细胞因子IL-10在两种感染中均未检测到，提示E. dispar通过独特信号通路限制黏膜炎症。C57BL/6NCrSlc小鼠背景可能对炎症反应有衰减，但E. histolytica的典型致病特征仍被稳健再现。与先前使用无共生E. dispar菌株AS16IR的研究相比，NA442的定植能力差异可能反映了营养和代谢适应的不同。该研究还强调，NA442与泰国菌株的STR匹配提示区域流行病学联系，但感染途径仍不确定。研究局限性包括：单菌培养可能部分反映细菌共培养生理状态，C57BL/6NCrSlc背景可能低估炎症反应，观察窗口仅代表早期定植阶段，以及仅基于单一临床分离株。
**研究结论翻译**：最终，本研究不仅为比较发病机制研究建立了一个有价值的E. dispar菌株，而且突出了日本Entamoeba感染可能发生的流行病学变化。持续监测对于确定E. dispar感染是否可能在日本人群中更广泛出现将非常重要。
