枸杞多糖通过SIRT3介导的NLRP3去乙酰化作用抑制炎症，从而减轻缺血性中风

《Stroke and Vascular Neurology》：Lycium barbarum glycopeptide attenuates ischaemic stroke by inhibiting inflammation via SIRT3-mediated NLRP3 deacetylation

　　摘要
背景：炎症反应在缺血性中风中起着关键作用。NLRP3的乙酰化是加剧神经炎症的重要步骤。来自枸杞的生物活性糖蛋白LbGP具有抗炎潜力，但其在中风后神经炎症中的作用机制尚不清楚。目的：本研究旨在探讨LbGP在减轻缺血性中风后神经炎症方面的功效及分子机制。方法：采用大脑中动脉闭塞/再通小鼠模型来诱导局灶性脑缺血/再通损伤。将小胶质细胞置于缺氧-葡萄糖剥夺/再氧环境中。通过Y迷宫试验和开放场地试验评估神经功能恢复情况。利用西方印迹法、ELISA、共免疫沉淀法和免疫荧光法探究其分子机制。结果：LbGP显著减少了I/R小鼠的脑梗死体积，减轻了神经炎症，并促进了功能恢复。从机制上来看，LbGP通过Sirtuin 3介导抑制NLRP3的乙酰化来阻止NLRP3炎性小体活化，这一结论在Sirt3基因敲除小鼠中得到了进一步验证，因为这些小鼠的神经炎症更为严重。结论：本研究首次表明，LbGP通过Sirt3介导的NLRP3去乙酰化来减轻中风后的神经炎症，从而阻断炎性小体活化，表明LbGP是治疗缺血性中风的有希望的候选药物。

已有研究认知：NLRP3的乙酰化会引发缺血性中风中的神经炎症。
本研究的贡献：LbGP通过上调SIRT3来抑制NLRP3的乙酰化及炎性小体活化，进而缓解缺血性中风。
本研究对研究、实践或政策的潜在影响：LbGP是一种有前景的中风口服治疗候选药物，而SIRT3介导的NLRP3去乙酰化则是一个潜在的抗炎靶点。

引言
缺血性中风占全球中风病例的80%以上，仍是导致死亡和永久性残疾的主要原因，给社会经济带来了沉重负担。虽然溶栓和取栓术旨在在狭窄的治疗窗口内恢复脑部血流，但它们的临床益处往往会被缺血/再通损伤所抵消——这是一种矛盾的级联反应，再血管化会通过氧化应激和神经炎症加剧组织损伤。1 关键的是，脑缺血损伤分为两个阶段：初级损伤，表现为血管阻塞后立即出现的能量衰竭和神经元坏死；二级损伤，则是由延迟发生的神经炎症反应引发，会在数天内进一步加重组织破坏。2 由脑缺血/再通引起的二级损伤是导致缺血性中风病情加重及预后不良的核心因素。在临床治疗和基础研究中，抑制二级损伤都被视为改善中风预后的关键目标。因此，抑制二级损伤既是临床实践也是基础研究中的重要治疗目标，而抑制神经炎症可能是减轻缺血性中风后脑部损伤的有效策略。

焦亡是一种程序性细胞死亡形式，具有强烈的促炎效应。这一机制由NOD样受体家族中的pyrin结构域3（NLRP3）所介导。3 4 一旦被激活，NLRP3会与含有CARD结构的凋亡相关斑点蛋白以及前半胱天冬酶-1结合，形成NLRP3炎性小体。5 炎性小体活化的特征是活化的半胱天冬酶-1会形成气道蛋白D膜孔，导致细胞肿胀并释放促炎细胞因子。6 最新的研究证据表明，神经炎症是连接这两个损伤阶段的枢纽。在缺血/再通发生后，死亡的神经元会释放损伤相关分子模式，从而触发小胶质细胞的活化。7 这些被活化的胶质细胞，尤其是小胶质细胞，会通过NLRP3炎性小体持续产生神经毒性——该多蛋白复合物的完全活化依赖于NLRP3的乙酰化。5 8 乙酰化的NLRP3会招募ASC和前半胱天冬酶-1，形成功能性的炎性小体，这些炎性小体会切割气道蛋白D，引发焦亡性细胞死亡，并释放白细胞介素-1β和IL-18，从而形成自我放大的炎症循环。4 值得注意的是，翻译后修饰，尤其是乙酰化，能精确调控NLRP3的活化，但目前针对这一过程的治疗策略仍不完善。8 9

NAD+依赖性的去乙酰化酶家族中的Sirtuin蛋白已被证实是调控炎症相关翻译后修饰的关键因子。其中，定位于线粒体内膜的Sirtuin 3具有强大的去乙酰化活性，可在心血管疾病和神经退行性疾病中减轻氧化应激和炎性小体活化。10 11 此外，Sirt3基因的缺失会加剧脑缺血/再通损伤，这说明它在神经保护中起着关键作用。12 13 然而，天然化合物是否能够利用Sirt3来抑制中风中的NLRP3乙酰化，目前尚未有相关研究。

枸杞作为一种传统中药，已被广泛用于治疗多种疾病。14–16 来自枸杞的糖蛋白-多糖复合物LbGP（蛋白质含量为30%）具有免疫调节和神经保护作用。17 虽然先前的研究已证实其在慢性模型中的抗炎效果，但它能否通过Sirt3来抑制中风中的急性期NLRP3乙酰化，目前尚不清楚。在本研究中，我们探讨了LbGP在治疗脑缺血/再通损伤中的潜在机制。通过蛋白质免疫印迹法和免疫荧光染色，我们发现LbGP能显著减轻脑缺血/再通损伤后的神经炎症。据我们所知，这是首项证明LbGP可通过特异性调控Sirt3来抑制NLRP3乙酰化的研究。这一调控过程阻断了炎性小体配体ASC的相互作用，抑制了炎性小体的活化，从而发挥了其抗炎作用。我们的研究结果表明，LbGP有望成为临床治疗和预防缺血性中风的新策略。

材料与方法
动物与处理
实验用雄性C57BL/6小鼠（6–8周龄）购自中国潍坊山东第二医科大学动物实验中心。Sirt3-/-小鼠则从上海模式生物中心购买。本研究已获得山东第二医科大学动物伦理委员会的批准（编号2024SDL659），并遵循NIH关于实验室动物护理和使用的指南。枸杞糖肽LbGP（由宁夏中宁枸杞院士工作站提供）在MCAO手术前以10?mg/kg/天的剂量口服给药，连续14天。

MCAO/R模型
MCAO/R模型的建立方法如前文所述。18 再通24小时后，使用改良的神经功能严重程度评分系统来评估神经功能。行为测试结束后，给小鼠实施深度麻醉并通过颈椎脱位的方式将其处死。通过心脏穿刺采集血液，然后在4℃下以3000×g的转速离心15分钟，分离出血清并储存在-80℃条件下。脑组织则在冰上解剖，同侧脑半球要么在液氮中快速冷冻以便进行分子检测，要么在4%多聚甲醛中固定24小时，之后进行石蜡包埋和切片，用于组织病理学分析。

神经功能测试
采用改良的神经功能严重程度评分系统来评估神经功能，该系统可检测运动、感觉、平衡、反射和行为等方面的状况。运动功能通过爬梯能力和握力来评估；感觉功能通过对轻触的反应来检测；平衡能力通过走平衡木测试来评定；反射能力则通过本能反应和自我矫正能力来观察。所有行为测试都在上午9:00至12:00之间进行，以减少昼夜节律带来的差异。

转角测试
在手术前，所有小鼠都要接受为期三天的习惯训练，每天进行三次测试，以此排除运动学习能力的差异。测试在MCAO术后24小时进行。将小鼠置于两块相互成30度角的斜板之间，每块板的尺寸为30厘米×20厘米×1厘米，两者之间形成一个狭窄的通道。未受伤的小鼠在触须受到刺激时会随机向左或向右转动，而脑部受损的小鼠则会有明显的方向偏好。在10次测试中记录每只小鼠向左和向右转动的次数，然后计算不对称指数（向左转动次数/总转动次数），以此评估感觉运动功能障碍的程度。

Y迷宫测试
Y迷宫由三段长度相等的通道组成，分别标记为A、B和C，每对相邻通道之间的夹角为120度。实验开始时，将小鼠放在随机选择的一条通道的末端，让其自由探索8分钟。摄像头系统会自动记录小鼠进入各通道的顺序、每次进入通道的次数以及正确的自发交替频率。总的通道进入次数可作为整体运动活跃度的指标。每次测试结束后，都会清除粪便残渣，并用75%乙醇擦拭迷宫，以消除气味信号。

开箱活动测试
首先将每只小鼠放在一个50厘米×50厘米×40厘米的盒子角落里，然后通过位于盒子上方的摄像头记录其在10分钟内的移动总距离和行走路径。视频跟踪系统用于分析以下参数：(1)移动总距离（厘米），用于评估运动活跃度；(2)在中心区域停留的时间（秒），用于判断类似焦虑的行为，其中中心区域定义为场地中央的一个25厘米×25厘米的正方形区域。每次测试结束后，都会用75%酒精清洁设备，以避免前一只小鼠留下的信息（如体型、尿液、气味等）影响后续测试的结果。所有测试都在固定的时间范围内进行，即上午9:00至12:00。整个实验过程中都采用了随机化和盲法评分。

HE染色与尼氏染色
将经过二甲苯和逐级酒精处理的5微米厚的脑组织石蜡切片用苏木精-伊红染色液进行染色。处理后的切片还进行了尼氏染色。在用无水乙醇脱水、二甲苯澄清以及中性树脂封片之后，通过光学显微镜分析染色结果。

细胞培养与处理
在本研究中，使用BV2细胞进一步探究体外机制。将这些细胞置于含5%二氧化碳、1%氧气和94%氮气的缺氧环境中，37℃下在不含葡萄糖的DMEM培养基中培养4小时。之后，让细胞在含5%二氧化碳、37℃的正常氧分压环境下，在添加了葡萄糖的DMEM培养基中恢复12小时，以此模拟缺氧-葡萄糖剥夺/再氧环境。对于LbGP处理组，分别在缺氧-葡萄糖剥夺开始前2小时、缺氧-葡萄糖剥夺期间以及再通开始后2小时给予LbGP处理。通过CCK-8试剂盒检测不同浓度和不同处理时间对细胞存活率的影响，最终选择200微克/毫升的LbGP浓度处理24小时，作为后续实验的用药剂量（详见在线补充图1）。

免疫荧光染色
抗原提取完成后，将脑组织切片置于含有1% Triton X-100的PBS溶液中，使细胞膜通透，随后用10%山羊血清封闭，再进行一抗和二抗的孵育。之后加入含有DAPI的荧光封片剂（ORIGENE，ZLI-9557，中国），对细胞核进行染色，最后将玻璃载玻片封片固定。

免疫沉淀与西方印迹法
将同侧脑半球的脑组织在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冰冷RIPA缓冲液中匀浆（Solarbio，R0010，中国）。匀浆液在4℃下以12,000×g的转速离心15分钟。上清液与抗NLRP3抗体（Proteintech，68?102–1?Ig）在4℃下孵育12小时，之后再加入蛋白A+G磁珠继续孵育2小时。将磁珠收集到磁架上（Beyotime，FMS008，中国），用裂解缓冲液洗涤三次，然后在95℃下用SDS-PAGE样品加载缓冲液（1×）煮沸5分钟。洗脱出的蛋白质随后进行SDS-PAGE电泳和西方印迹分析。

ELISA分析
获取新鲜的脑组织，然后加入PBS提取上清液，利用ELISA试剂盒（江莱生物技术有限公司，上海，中国）检测脑组织中的TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-18含量。

流式细胞术
首先用眼科剪将脑组织切成1立方毫米的小块，然后用胰蛋白酶将其溶解30分钟。之后，将组织通过300目筛过滤，得到单细胞悬液，再在1000×g的转速下离心。用CD45-FITC（Proteintech，FITC-65109）、CD4-PE（Proteintech，PE-65104）、CD8-PE（Proteintech，PE-65069）和CD11b-PE（Proteintech，PE-65055）对细胞进行染色。最后使用BD Accuri C6 Plus流式细胞仪进行分析。

生物信息学分析
GSE131193数据集是从GEO数据库中获取的。该数据集来源于Kestner等人的一项研究。19 雄性C57Bl/6J小鼠接受了60分钟的短暂MCAO处理或假手术。在手术后的24小时或7天，分离出同侧的脑微血管，使用Illumina NextSeq 500平台进行mRNA测序。在本研究中，选择了中风后24小时的同侧样本进行分析，包括假手术组（Sham-1d-ipsilateral_1、Sham-1d-ipsilateral_2、Sham-7d-ipsilateral_1和Sham-7d-ipsilateral_2）以及短暂MCAO组（Stroke-1d-ipsilateral_2、Stroke-1d-ipsilateral_3、Stroke-7d-ipsilateral_1和Stroke-7d-ipsilateral_2）。基因注释工作使用GPL19057平台完成。差异表达分析则是在R软件的limma包中进行的，筛选标准为|log?FC|>0.585且p<0.05。

统计分析
统计分析采用GraphPad Prism V.9.0软件完成。为了比较假手术组、缺血/再通组以及缺血/再通+LbGP组的差异，使用了单因素方差分析。当方差分析结果显著时，再使用Tukey事后检验进行两两比较。显著性水平分别定义为*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001，所有数据均以均值±标准差的形式呈现。

结果
LbGP通过抑制炎症反应减轻缺血性中风
为了确定LbGP是否对缺血性中风具有保护作用，我们测量了不同组小鼠的脑梗死体积。在建立MCAO/R模型之前，小鼠通过灌胃方式每日接受10毫克/公斤体重的LbGP治疗，连续14天。2,3,5-三苯基四氮唑氯化物染色结果显示，与I/R组相比，LbGP显著降低了梗死体积（图1A、B）。此外，ELISA分析表明LbGP降低了IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，同时提高了IL-10的水平（图1C–F）。流式细胞术分析显示，LbGP减少了I/R损伤后CD45+CD4+ T细胞、CD45+CD8+ T细胞以及CD45++CD11b+髓系细胞的浸润程度（图1G）。免疫荧光染色结果显示，LbGP减少了梗死周边区域Iba-1阳性小胶质细胞的数量（图1H、I），同时降低了CD86+（M1型）小胶质细胞的数量，增加了CD206+（M2型）小胶质细胞的数量（在线补充图2），这表明其作用机制可能偏向于抗炎方向。体外实验中，胆囊收缩素八肽检测证实LbGP提升了小胶质细胞的存活率（图1J），而ELISA检测则显示LbGP降低了促炎细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的水平，同时提高了IL-10的水平（图1K–N）。总体而言，这些研究结果表明LbGP通过抑制神经炎症发挥对缺血性卒中的保护作用。

LbGP通过抑制NLRP3炎性小体来抑制炎症反应。共免疫沉淀实验显示，LbGP削弱了ASC与NLRP3之间的相互作用（图2A）。体外实验中，LbGP抑制了I/R损伤引发的NLRP3、caspase-1及其下游促炎细胞因子IL-18和IL-1β的过度表达（图2B–G）。在体内实验中，LbGP降低了切割后的caspase-1及GSDMD-N的表达水平（图2H–K）。免疫荧光实验进一步证实，LbGP降低了I/R损伤小鼠大脑皮层中caspase-1和GSDMD的表达水平（图2L、M）。这些研究结果表明，LbGP能够抑制脑部I/R损伤后的NLRP3炎性小体激活。

LbGP可降低缺血性卒中后的NLRP3乙酰化水平。通过使用广谱乙酰化抗体，我们发现LbGP显著降低了脑组织中的总蛋白乙酰化水平（图3A）。免疫沉淀实验进一步表明，LbGP抑制了NLRP3的乙酰化过程（图3B、C）。对GSE131193数据集的分析显示，I/R损伤后Sirt3的表达显著下降，这提示它可能在缺血性卒中中发挥作用（图3D）。

LbGP通过Sirt3发挥抗炎抑制作用。I/R损伤后Sirt3的表达显著下降，而LbGP能够恢复其表达水平（图4A、B及在线补充图3）。为确定Sirt3在LbGP保护作用中的作用，研究人员让野生型小鼠和Sirt3基因敲除小鼠分别经历MCAO/R模型损伤，并给予LbGP处理。结果显示，经过LbGP处理后，Sirt3基因敲除小鼠的梗死体积明显大于野生型小鼠（图4C、D），这说明Sirt3是LbGP保护作用的关键介质。与之相应的是，Sirt3基因敲除小鼠中LbGP对Iba-1阳性小胶质细胞的抑制作用也被减弱（图4E）。此外，Sirt3基因敲除小鼠的小胶质细胞极化状态发生了改变，表现为CD86阳性（M1型）小胶质细胞增多，而CD206阳性（M2型）小胶质细胞减少（在线补充图4A–D）。同时，Sirt3基因敲除小鼠的促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平升高，而抗炎细胞因子IL-10的水平则下降（图4F–I）。综合来看，这些研究结果表明，Sirt3基因敲除会削弱LbGP在脑部I/R损伤中的抗炎保护作用，不过具体受影响的细胞类型仍有待进一步确定。

LbGP通过Sirt3介导的机制抑制NLRP3乙酰化来发挥抗炎作用。共免疫沉淀实验显示，Sirt3基因敲除小鼠中，LbGP诱导的NLRP3乙酰化抑制作用以及ASC与NLRP3的相互作用均有所减弱（图5A）。在Sirt3基因敲除小鼠体内，LbGP对切割后的IL-1β、caspase-1以及GSDMD的抑制作用也明显减弱（图5B–F）。免疫荧光实验进一步证实，Sirt3基因敲除小鼠中LbGP对GSDMD和caspase-1的抑制作用也被逆转（图5G–J）。总体而言，这些研究结果支持这样的观点：LbGP在缺血性卒中中的保护作用是通过Sirt3调控NLRP3的乙酰化水平来实现的。

LbGP通过调节Sirt3发挥神经保护作用。接受LbGP治疗的小鼠在Y形迷宫试验和开放场试验中的探索行为及运动能力均有提升（图6A–D）。与I/R组相比，接受LbGP治疗的小鼠的mNSS评分显著降低（图6E）。在转角试验和旋转棒试验中，LbGP治疗组小鼠的感觉运动功能也有改善（图6F、G）。综上所述，LbGP通过调节Sirt3并促进神经功能恢复来发挥神经保护作用。

尽管越来越多的证据表明缺血性卒中与神经炎症之间存在密切关联，但目前仍缺乏有效的药物治疗手段。在本研究中，我们证明了LbGP具有对抗缺血性卒中的神经保护作用。它能够显著降低梗死体积和脑水肿，减轻神经炎症，同时改善I/R损伤小鼠的神经功能及长期预后。值得注意的是，I/R损伤后梗死周边区域的周围免疫细胞浸润会增加，进而导致认知功能下降。据我们所知，这是首次证明LbGP可通过上调Sirt3来减轻卒中引发的神经炎症。Sirt3的上调能够抑制NLRP3的乙酰化，从而降低NLRP3炎性小体的激活程度，维护中枢神经系统的稳态。此外，LbGP还能减少CD11b+髓系细胞的数量，这说明小胶质细胞是LbGP抗炎作用的主要靶细胞之一。

抑制神经炎症被视为减轻缺血性卒中后继发性损伤的重要策略。NLRP3介导的神经炎症会显著加重脑部I/R损伤。NLRP3是一种胞质内的模式识别受体，负责抵御病原体的入侵。与其他受体不同，NLRP3缺乏CARD结构域，因此需要ASC和caspase-1的参与才能被激活，进而形成NLRP3炎性小体。这一复合体会促使caspase-1自我切割并活化，进而释放IL-1β和IL-18。活化的NLRP3炎性小体还会切割GSDMD，使其N端的功能孔形成结构得以释放，从而在细胞膜上形成直径约10–14纳米的孔洞，进一步加剧神经炎症。大量研究表明，NLRP3炎性小体的激活在缺血性卒中后的继发性损伤中起着重要作用，因此成为潜在的治疗靶点。NLRP3炎性小体的激活分为启动和活化两个阶段，这两个阶段都受到泛素化、磷酸化、硫酸化及棕榈酰化等蛋白质修饰的影响。多项研究指出，NLRP3的乙酰化在炎性小体激活过程中起着关键作用。我们的Western blotting和免疫荧光实验也证实，LbGP显著降低了caspase-1、GSDMD-N以及切割后的IL-1β的水平，同时脑组织中的总乙酰化水平也明显下降，这进一步证明了LbGP是调控NLRP3乙酰化的关键因子。

在研究初期，我们发现LbGP不仅能逆转缺血性卒中后Sirt3表达水平的下降，还能减少CD11b+髓系细胞的数量。需要指出的是，NLRP3的乙酰化是一个受多种去乙酰化酶和乙酰转移酶共同调控的动态过程。He等人通过质谱技术确定了NLRP3上的乙酰化位点，并证明SIRT2是NLRP3的主要胞质去乙酰化酶，SIRT2基因缺陷会加剧NLRP3炎性小体的激活。此外，p300/CBP等乙酰转移酶也被认为可以催化NLRP3的乙酰化，进而促进其活化。然而，本研究发现，在脑部I/R损伤后，是SIRT3而非SIRT2的表达显著下降，而LbGP处理则能够恢复SIRT3的表达水平。虽然我们不能排除SIRT2或p300/CBP在本研究模型中的作用，但现有数据表明，在脑部I/R损伤背景下，SIRT3可能是调控NLRP3乙酰化的关键因子。这一发现与相关研究结果一致，即作为sirtuin蛋白家族的一员，Sirt3和Sirt2都具有较强的去乙酰化活性。因此，我们推测SIRT3可能是抑制脑部I/R损伤后NLRP3乙酰化的关键靶点。共免疫沉淀实验分析了LbGP处理后NLRP3的乙酰化水平及其与ASC的结合情况，结果表明LbGP不仅降低了NLRP3的乙酰化水平，还阻断了其与ASC的相互作用。此外，当在Sirt3基因敲除小鼠中给予LbGP时，由于缺乏Sirt3，LbGP对NLRP3炎性小体的抑制作用也就无法显现。这些研究结果表明，LbGP的神经保护作用源于其抑制炎症的能力，尤其是通过调控Sirt3来调节NLRP3炎性小体的激活程度（在线补充图5）。相较于现有的Sirt3激动剂（如Trilobatin）和NLRP3抑制剂（如MCC950），LbGP在卒中治疗方面具有以下独特优势：第一，跨模型验证效果更好——Trilobatin主要在I/R模型中被验证过功效，而LbGP在ICH和I/R两种机制截然不同的模型中均显示出治疗效果，这说明它的临床应用潜力更大；第二，安全性更高——MCC950存在脱靶效应和肝毒性，限制了其临床应用前景。而LbGP源自枸杞，这是一种有着2500多年安全使用历史的“药食同源”传统中药材，现代研究也证实，在推荐剂量下它不具有毒性。第三，口服生物利用度高——LbGP可以通过口服给药，便于对卒中患者进行长期治疗。综上所述，LbGP有望成为卒中治疗的理想候选药物。

当然，本研究也存在一些局限性。首先，关于LbGP对小胶质细胞NLRP3炎性小体激活的抑制作用，我们的体内实验数据主要来自全脑组织裂解液，因此无法确定LbGP的抗炎作用是否 specifically由小胶质细胞介导。尽管小胶质细胞是中枢神经系统中神经炎症的主要介质，但全脑分析无法排除其他细胞类型（如神经元、星形胶质细胞、浸润的免疫细胞）的贡献。此外，全身性Sirt3基因敲除小鼠所表现出的表型仅能说明作用的SIRT3依赖性，而非小胶质细胞的特异性，因为SIRT3在多种细胞中都有表达。而且，BV2细胞并不能完全模拟原始小胶质细胞的功能，仅依靠CD11b标记也无法区分驻留的小胶质细胞与浸润的单核细胞/巨噬细胞，因为目前还没有专门针对小胶质细胞的标记物（如TMEM119或P2RY12），也无法通过CD45的强度来进行准确区分。其次，从机制深度来看，由于使用了广谱乙酰化抗体，我们无法确定NLRP3上具体的赖氨酸残基发生乙酰化，因此只能得出整体NLRP3乙酰化水平的变化情况。此外，目前尚未确认LbGP与SIRT3或NLRP3之间存在直接的物理结合，我们的数据也无法区分是SIRT3被直接激活，还是仅其表达水平上升。SIRT3与NLRP3之间的直接酶学关系也尚未明确——我们既没有提供两者直接相互作用的证据，也没有使用无催化活性的SIRT3突变体进行 rescue实验。另外，目前还不清楚NLRP3乙酰化水平的下降是直接导致ASC与NLRP3的结合减少，还是这两种变化是同步发生的。第三，从实验设计及临床转化角度而言，本研究采用的预防性给药方案（在MCAO/R模型建立前连续14天灌胃给药）虽然有助于在最大程度上增加药物暴露量，从而更深入地验证SIRT3-NLRP3通路的作用机制，但它并不符合急性缺血性卒中临床治疗的实际情况，因为在临床中必须在卒中发生后尽快开始治疗。目前还不知道LbGP在小鼠体内的分布情况——尽管枸杞具有良好的安全性，但LbGP是否能穿过血脑屏障、其在脑组织中的浓度、半衰期以及代谢途径都尚未明确。尽管采取了多种控制措施（固定测试时间、中心区域分析、习惯化训练），但行为学检测结果仍可能受到动物整体活动状态、焦虑情绪以及基础生理状况的影响。此外，本研究也未评估28天之后的长期功能恢复情况，因此无法了解LbGP对神经系统恢复及动物生存率的长期影响。

这类局限性在神经炎症相关研究中十分常见。未来的研究需要借助小胶质细胞特异性条件性基因敲除小鼠、原代培养细胞、缺乏乙酰化功能/具有模拟乙酰化功能的NLRP3突变体、质谱技术、分子对接技术、表面等离子体共振技术、细胞热位移分析技术、药代动力学研究、临床给药方案以及直接的SIRT3-NLRP3相互作用检测方法，以便进一步验证我们的研究结论。

总之，本研究表明，LbGP通过上调Sirt3的表达来减轻缺血性卒中后的神经炎症，而Sirt3又能抑制NLRP3的乙酰化及炎性小体的激活。这些发现表明LbGP是治疗脑部I/R损伤的极具潜力的候选药物，同时也为开发新的卒中治疗方法提供了重要线索。

脚注：BH、CM和LZ对本文的贡献相当。
参与者：MH负责研究的设计与监督工作；BH、YL、CM、LZ和SM共同撰写了论文；BH、CM和MB负责实验操作及数据分析；MD、JG、JL、CS和ZY参与了数据分析工作；YL和MH负责文章的审阅、编辑及整体监督。所有作者均阅读并通过了最终稿件，YL为本文的担保人。
资金支持：本研究得到了山东省自然科学基金（项目编号ZR2024MH246）、国家自然科学基金（项目编号82101410）、山东第二医科大学科研创新计划项目（项目编号2021BKQ009和2021BKQ007）、潍坊市科技发展计划项目（项目编号2024YX043）、山东省卫生健康科技创新团队建设项目以及“源渡学者”计划的资助。
利益冲突：无。
文章来源与同行评审：该研究并非委托撰写，而是经过外部同行评审。
补充材料：这些内容由作者提供，尚未经过BMJ Publishing Group Limited的审核，也可能未经同行评审。其中所表达的观点和建议仅代表作者个人意见，不代表BMJ的立场。BMJ不对任何基于这些内容而做出的决策承担任何责任。如果内容中包含任何翻译材料，BMJ不保证这些翻译的准确性和可靠性（包括但不限于当地法规、临床指南、术语、药物名称及剂量），并且不对因翻译、调整或其他原因导致的任何错误和/或遗漏负责。数据可用性声明伦理声明患者出版同意书：不适用。伦理审批：本研究未涉及人类参与者。本研究中的所有动物实验均经过了山东第二医科大学动物伦理委员会的审核与批准（编号2024SDL659）。致谢我们感谢Kwok-Fai So的宝贵意见，以及宁夏中宁枸杞院士工作站的支持。