综述：等离子体增强斑点与分子指纹技术的结合：暗场光散射成像与表面增强拉曼散射的整合应用

《TRAC-TRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY》：Bridging plasmon enhanced spot and molecular fingerprinting: Dark-field light scattering imaging integrated with surface-enhanced Raman scattering

　　摘要：在动态且复杂的环境中，为克服单一模式分析的局限性，双模态整合已成为一种必要的解决方案。由于暗场光散射成像与表面增强拉曼散射各自具备互补优势，二者结合已被用作生化检测领域的双模态散射技术。暗场光散射成像能够以高对比度、高信噪比呈现纳米粒子的空间分布，但缺乏特异性；而表面增强拉曼散射可提供精确的分子指纹，却存在受基底影响导致的空间不均匀性问题。整合后的DFLSI-SERS平台通过“定位-识别”的协同策略有效解决了这些缺陷，可实现纳米结构形态与化学成分的高分辨率同步原位分析。本综述总结了DFLSI-SERS平台的基本原理与优势，并详细探讨了兼具优异共振光散射性能和SERS增强效应的双功能探针设计方法。同时阐述了该技术在生化分子检测、细胞成像分析、化学反应与结构演变的动态监测以及环境微/纳米污染物分析等多学科领域的应用前景。此外，还分析了当前面临的技术挑战与未来发展方向，重点包括平衡型双模态探针的合理设计、更强的抗基质干扰能力、时空同步的数据采集方式以及算法辅助的多模态数据处理。总体而言，本综述展现了DFLSI-SERS在推动分析科学及相关领域创新突破方面的巨大潜力。

引言：随着材料科学的持续发展，纳米技术在催化[1]、生物医学[2][3]以及化学分析[4][5]等领域取得了重大进展。然而，当纳米材料被应用于复杂且动态的环境中时，仅依靠单一观测模式往往难以满足需求[6]。为了实现全面了解，必须将结构变化的可视化与化学识别相结合。因此，双模态策略的互补性与交叉验证功能对于提升分析的准确性与灵敏度至关重要。近年来，光学成像与光谱分析的结合形成了一种强大的双模态技术体系，它不仅能揭示纳米结构的空间分布与形态演变，还能通过精确的化学分析确定分子组成，从而有效弥补单一模式方法的固有缺陷。

长期以来，为展现纳米尺度上的结构特征与微观行为，光学成像技术不断迭代创新。19世纪中叶，斜入射照明技术的发展推动了暗场显微镜的诞生[7]。1903年，该技术首次被用于观察胶体金粒子，突破了当时光学分辨率的限制[8]。基于暗场显微镜，暗场光散射成像技术应运而生。这是一种利用暗场显微镜捕捉样品产生的瑞利散射（弹性散射）光信号的成像方法。暗场显微镜的核心在于其聚光器，该聚光器配备有遮挡直射光的不透明光圈。这一设计确保仅能收集到与样品相互作用后产生的散射光信号，从而在完全黑暗的背景上形成明亮的样品图像。与明场显微镜相比，暗场显微镜能有效抑制背景干扰，实现高对比度与高时空分辨率。此外，该技术相比荧光显微镜更具成本优势且操作更为简单，同时还能有效避免光漂白和光毒性问题[9]。尤为重要的是，它无需染色即可检测大肠杆菌[10]和肺炎衣原体[11]等病原体。自2000年以来，随着暗场光散射成像技术的不断发展，现已可实现单个纳米级粒子的高分辨率成像，这一技术还为微观反应的原位实时监测提供了有力工具[12][13][14]。

凭借其高对比度与高分辨率成像优势，暗场光散射成像技术被广泛用于实时原位监测[15][16]，包括纳米级探针合成过程[17]及化学反应的分析。此外，它还能实现单粒子检测，可高灵敏度地检测无机离子[19][20]、蛋白质[21][22][23]、核酸[24][25]、细菌[26]以及病毒[27]。要实现如此高的检测灵敏度，探针需要具备强劲的散射信号、优异的生物相容性以及高效的富集能力。因此，各种纳米粒子，如磁性纳米粒子[28][29]、半导体纳米粒子[30]、介电纳米粒子[31][32]以及等离子体纳米粒子[33]，均可作为暗场光散射成像的光学探针。其中，基于金和银的等离子体纳米粒子，如金纳米球[AuNPs][34]、金纳米棒[AuNRs][35]、金纳米三角形[AuNTs][36]以及银纳米球[AgNPs][37]，因其出色的光学特性而被广泛使用[38][39][40]。这类等离子体纳米粒子由于自由电子与入射光电磁场的相互作用，会表现出局域表面等离子体共振散射现象。局域表面等离子体共振所特有的强局部电场能够显著放大弹性散射截面，使得这些纳米粒子在暗场光散射成像下呈现出异常明亮且色彩鲜明的信号[41][42]。依托这些独特性质，暗场光散射成像技术能够精准定位细胞内的等离子体纳米粒子，被应用于细胞成像[43]和肿瘤诊断[44]等领域。然而，在复杂的生物环境中，暗场光散射成像的实际性能常常受到探针抗背景干扰能力有限的制约[45]。在复杂样品或生物环境中，探针的散射信号容易受到背景干扰，从而导致信噪比下降、检测灵敏度降低，进而影响分析结果的可靠性。因此，将暗场光散射成像技术与高灵敏度、高特异性的检测方法相结合，构建综合分析策略，有望大幅拓展该技术在复杂系统中的应用价值。

与暗场光散射成像类似，表面增强拉曼散射也主要依赖于金、银等等离子体纳米粒子的局域表面等离子体共振效应[46][47][48]。该效应会在纳米粒子表面或间隙位置产生高度局域化的增强电场“热点”，使拉曼信号强度提升数个数量级[49][50]。在过去四十年间，凭借高灵敏度[51]、高特异性[52]、无损检测特性以及抗光漂白和光降解能力[53][54][55]，表面增强拉曼散射已在化学[56]、材料科学[57]以及生物医学[58]等领域得到广泛应用。它在肿瘤诊断[59]、病原体检测[60]、食品与药品检测[61]、化学反应监测[62]、环境监测[63][64]以及pH值检测[65]等方面也展现出广阔的应用前景。不过，表面增强拉曼散射仍面临一些难题，如拉曼增强“热点”分布难以控制[63]，以及其对基底依赖性较强[66]，从而导致检测结果的重现性较差。

将暗场光散射成像与表面增强拉曼散射相结合，可形成一种互补策略，用以克服单一技术各自的局限性。暗场光散射成像能够提供直观的空间定位信息与等离子体散射特征，有助于识别具有表面增强拉曼散射活性的区域；而表面增强拉曼散射则能提供分子振动指纹，弥补暗场光散射在复杂样品中化学特异性不足的缺陷[67]。这种互补性提升了检测的可靠性、准确性及实际应用价值，也推动了相关联的、集成化的DFLSI-SERS平台的发展。1999年，Michaels等人[68]首次报道了从同一银纳米晶体同时测量瑞利散射信号与单分子表面增强拉曼散射信号的研究，发现这两种信号的强度并非简单成正比，这凸显出进行位点相关表征的必要性。2006年，Itoh等人[69]开发出了集成型的暗场显微镜与表面增强共振拉曼散射系统，得以对单个银纳米聚集体同时测量等离子体散射信号与表面增强共振拉曼散射信号，进而揭示了激发条件及等离子体共振特性对表面增强共振拉曼散射的影响。到2011年，Asiala和Schultz[70]将暗场高光谱成像技术与拉曼显微光谱与成像技术相结合，用于分析表面增强拉曼散射基底上“热点”的分布，将该技术从点光谱分析扩展到了二维成像领域。2012年，Kang等人[71]进一步将暗场光散射成像技术与共聚焦微拉曼仪器相结合，实现了对单个活细胞的结构与分子信息的同步获取。迄今为止，DFLSI-SERS集成技术不断取得新进展，其应用范围已拓展至单粒子分析[72]、细胞成像[73]以及化学反应的实时监测[74]等领域。

近年来，已有众多综述总结了表面增强拉曼散射[75][76][77]与暗场光散射成像[67][78][79]各自的发展历程与应用现状。为克服单一模式的局限性，人们越来越多地采用暗场光散射成像与表面增强拉曼散射的集成技术，以解决同时分析纳米结构与化学成分这一关键难题。该技术在生物医学、化学反应动态监测以及环境分析等领域展现出独特优势。尽管这类集成技术具有极强的互补性且应用前景广阔，但针对该主题的系统综述仍然较少。因此，本文首次对DFLSI-SERS技术的研究进展进行了全面总结，期望能为推动该技术从理论探索走向实际应用提供系统性的指导。文章首先介绍了该集成技术的基本原理、仪器发展历程及其独特优势，并通过与高光谱成像、荧光显微镜以及电化学等其他集成技术的比较，突出了其在多模态分析中的优势。此外，对于DFLSI-SERT来说，探针的设计至关重要，因此本文重点总结了那些兼具优异表面增强拉曼散射活性与暗场散射特性的探针设计策略，包括各类等离子体探针及其阵列。在应用层面，本文全面总结了该技术在生化检测、细胞成像分析、化学反应与结构演变的动态监测以及环境微/纳米污染物分析等方面的突破性成果。最后，从双模态探针的构建与性能优化、双模态信号的同步采集、图像数据分析和光谱数据分析四个角度对该技术进行了总结与展望，希望能为推动该技术在实际检测与分析中的应用提供参考，也为相关研究人员带来有益启示。

DFLSI-SERS集成平台的构建：暗场光散射成像与表面增强拉曼散射是基于不同散射机制的光学技术，二者结合后可提供互补的纳米尺度信息。暗场光散射成像是一种能够捕捉局域表面等离子体共振增强型弹性散射光信号的成像技术。其核心部件为带有中央不透明挡板的暗场聚光器，该挡板可阻挡直射的白光，仅让斜向的边缘光线照射样品，随后物镜便能收集到来自纳米粒子的散射光，而背景信号则会被有效排除。

DFLSI-SERS集成平台用的高灵敏度探针：探针的光学特性直接决定了表面增强拉曼散射信号的放大程度以及暗场光散射成像的质量。在该双模态成像平台上，暗场光散射成像能够捕捉到由于探针尺寸、成分或聚集状态变化而引发的局域表面等离子体共振光谱位移，从而产生明显的颜色/色调变化[140][141]；与此同时，表面增强拉曼散射则可通过强烈的局部电场与电荷效应，对化学分子的拉曼信号实现电磁与化学层面的增强作用。

生化分子的检测：准确识别并定量分析生化成分对于疾病的早期诊断[206]、食品安全检测[207]以及细胞生理学研究[208]具有重要意义。传统的单一模式光学检测往往存在灵敏度不足[209]、特异性欠缺[210]以及抗干扰能力差[211]等问题。将暗场光散射成像的单粒子定位能力与表面增强拉曼散射的分子指纹识别能力相结合，便能形成一种极为强大的检测手段。

结论与展望：作为一种集成化的双模态分析技术，暗场光散射成像与表面增强拉曼散射的有效结合，将暗场成像的单粒子定位能力与拉曼光谱的分子指纹识别优势融为一体。该技术在操作简便性、成本效益以及检测特异性等方面都具有显著优势，已成为微观与纳米尺度原位分析的强大工具。不过，当应用于更为复杂的跨学科研究场景时，该技术领域仍需进一步发展。

作者贡献说明：陆毅伟：论文撰写——综述与编辑、原始稿撰写、图像制作；李建军：论文撰写——综述与编辑；朱健：论文撰写——综述与编辑；赵俊武：论文撰写——综述与编辑、研究指导、资金申请；翁国军：论文撰写——综述与编辑、资金申请、概念构思。

利益冲突声明：作者声明不存在任何财务利益冲突。

致谢：本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号62375213和62275214）的支持。

陆毅伟|李建军|朱健|赵俊武|翁国军
中国西安交通大学生命科学与技术学院教育部生物医学信息工程重点实验室，陕西省西安市西安宁西路28号，邮编710049