《Autophagy》：Molecular switches of SQSTM1: the impact of post-translational modifications on autophagy and neurodegeneration
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SQSTM1/p62（sequestosome 1，泛素结合蛋白p62）是参与许多细胞信号传导过程（包括巨自噬/自噬）的重要受体蛋白。它是细胞稳态和细胞反应的分子枢纽。在自噬过程中，SQSTM1靶向泛素化货物进行降解，从而维持细胞的蛋白质稳态。在结构上，SQS
SQSTM1/p62（sequestosome 1，泛素结合蛋白p62）是参与许多细胞信号传导过程（包括巨自噬/自噬）的重要受体蛋白。它是细胞稳态和细胞反应的分子枢纽。在自噬过程中，SQSTM1靶向泛素化货物进行降解，从而维持细胞的蛋白质稳态。在结构上，SQSTM1包含多个结构域，这些结构域促进其与泛素化货物的结合、SQSTM1聚集包涵体的形成、与MAP1LC3/LC3（微管相关蛋白1轻链3）的相互作用，以及通过自噬途径介导清除。除了其结构外，SQSTM1的翻译后修饰动态地调节其在细胞内的功能。翻译后修饰——如磷酸化、泛素化、乙酰化、S-酰化和S-亚硝基化——对于调节SQSTM1的功能、定位以及与自噬组分的相互作用至关重要，从而影响SQSTM1在自噬途径中的作用。了解这些蛋白质修饰在调节自噬中的作用，可能为开发针对自噬失调疾病（如神经退行性疾病）的治疗策略提供更好的见解。本综述将讨论这些翻译后修饰在控制SQSTM1自噬定位和功能中的作用。
引言：SQSTM1/p62（sequestosome 1，泛素结合蛋白p62）是一种参与多种细胞过程的受体蛋白，包括自噬和泛素-蛋白酶体系统（UPS）。自噬和UPS具备清除细胞内受损和错误折叠蛋白质以及有毒物质的能力，在维持细胞蛋白质稳态中发挥不可或缺的作用。蛋白质稳态失调可能导致有毒蛋白质积累，进而引发神经退行性等各种疾病。UPS是一种降解途径，主要清除可溶性错误折叠蛋白而非不溶性聚集体。这些蛋白质或“货物”被标记上K48连接的泛素链，发出通过26S蛋白酶体破坏的信号。SQSTM1可通过其泛素结合（UBA）结构域与这些泛素标记的货物结合，并将其引导至蛋白酶体进行降解。在蛋白酶体应激或存在较大聚集体的情况下，未被蛋白酶体降解的蛋白质会被引导至自噬途径进行清除。自噬是一种受到严格调控的降解过程，负责清除带有泛素链标记的受损细胞器和有毒或聚集的蛋白质。自噬分为三种类型：微自噬、伴侣介导的自噬/CMA和巨自噬。巨自噬是目前研究最为透彻的途径，也是本综述的重点，下文简称为“自噬”。自噬是一种选择性的细胞清除途径，始于吞噬泡（一种双层膜前体结构）的形成，吞噬泡吞噬目标废弃物，随后成熟并闭合形成自噬体。携带货物的自噬体与溶酶体融合形成自溶酶体，有毒的标记废弃物在溶酶体酶的作用下降解。自噬由保守的ATG（自噬相关）蛋白调控。MAP1LC3/LC3是自噬中的关键蛋白，属于Atg8家族蛋白，存在两种形式：LC3-I和LC3-II。LC3-I主要存在于细胞质中，而脂化的LC3-II存在于自噬体膜上。LC3的C端被半胱氨酸蛋白酶ATG4切割形成LC3-I。自噬体扩张需要将磷脂酰乙醇胺（PE）与LC3-I结合形成LC3-II。许多自噬货物受体通过其LC3相互作用区（LIR）与LC3-II结合。LC3-II的定位促进货物受体的招募并将有毒废弃物运送至吞噬泡。失调的自噬已成为各种神经退行性疾病的常见途径。例如，在阿尔茨海默病（AD）患者大脑中，观察到自噬体和自溶酶体的积累，这与PSEN1（早老素1）基因突变导致的溶酶体酸化功能丧失有关。在帕金森病（PD）中，特征是SNCA/α-突触核蛋白在路易体中聚集，且关键基因的突变导致自噬体-溶酶体融合减少。在亨廷顿病（HD）中，HTT（亨廷顿蛋白）基因突变导致N端多聚谷氨酰胺扩增形成突变型HTT（mHTT），阻碍自噬并导致空自噬体的积累。在肌萎缩侧索硬化症（ALS）中，多个相关基因编码核心自噬蛋白（包括SQSTM1），ALS相关的SQSTM1突变会损害其自噬功能。SQSTM1是自噬中的关键选择性货物受体。它通过C端的UBA结构域结合待降解的泛素化靶蛋白，并通过LIR结构域直接结合LC3。SQSTM1与LC3的相互作用导致吞噬受损蛋白的自噬体形成。在自噬过程中，SQSTM1会被主动降解，其降解增加是自噬潮增加的标志。泛素标记的错误折叠蛋白与SQSTM1的UBA结构域相互作用，驱动它们组装成聚集体。当SQSTM1结合多泛素化蛋白质时，会触发液-液相分离，这对液态SQSTM1体的形成和SQSTM1介导的选择性自噬是必需的。SQSTM1体作为平台介导蛋白质的自噬降解。SQSTM1招募上游自噬因子，包括NBR1（NBR1自噬货物受体）、TAX1BP1（Tax1结合蛋白1）和RB1CC1/FIP200（RB1诱导卷曲螺旋1），以在SQSTM1体周围诱导自噬体形成。SQSTM1通过其Phox-Bem1（PB1）结构域进行同源二聚化，形成SQSTM1丝状结构。NBR1通过PB1结构域与SQSTM1形成异源二聚体，并招募TAX1BP1，进而由TAX1BP1招募RB1CC1。RB1CC1与SQSTM1的相互作用将自噬机制招募到携带泛素化货物的SQSTM1体上，而LC3会竞争性取代RB1CC1，从而将泛素化蛋白聚集体装入自噬体中进行自噬降解。
从结构域到功能：SQSTM1的构建模块：SQSTM1是一种由440个氨基酸组成的蛋白质，包含多个结构域，包括N端Phox-BEM1结构域（PB1）、ZZ型锌指结构域、LIR、KIR（KEAP1相互作用区）和C端泛素结合（UBA）结构域。PB1结构域跨越N端的残基3-102，促进SQSTM1的同源二聚化和寡聚化，这对自噬至关重要。通过PB1结构域中K7和D69残基之间形成的氢键进行二聚化，是隔离自噬货物的基础。寡聚化促进多泛素化蛋白隔离入包涵体、SQSTM1体形成、SQSTM1与LC3的结合以及其在吞噬泡上的定位。LIR结构域对于介导多泛素化蛋白通过依赖SQSTM1的选择性自噬途径降解至关重要。紧邻LIR结构域下游的是KIR结构域，负责SQSTM1与KEAP1（Kelch样ECH相关蛋白1）的相互作用，从而通过KEAP1-NFE2L2通路调节自噬并促进抗氧化反应。在应激条件下，SQSTM1与NFE2L2/Nrf2（核因子红细胞2因子2）竞争结合KEAP1，导致NFE2L2激活。C端的UBA结构域跨越残基389-434，是SQSTM1与多泛素化蛋白质相互作用的核心调节因子，特异性识别K63连接的多泛素链。在正常情况下，UBA结构域的自二聚化阻止了其与泛素的相互作用；而与泛素结合会引起构象从二聚体向单体的转变。
SQSTM1在自噬中依赖磷酸化的功能：蛋白质磷酸化是调节各种细胞机制最常见的可逆翻译后修饰之一。SQSTM1在UBA结构域内被CSNK2/CK2（酪蛋白激酶2）、TBK1（TANK结合激酶1）和ULK1（unc-51样自噬激活激酶1）磷酸化于S403位点。响应蛋白酶体应激时，S403位点的磷酸化上调，增强SQSTM1对泛素化货物的亲和力并促进包涵体形成。S403磷酸化已被证明能增强新生自噬体对泛素化蛋白的吞噬。由SSH1介导的S403去磷酸化通过抑制SQSTM1与泛素化货物结合来破坏自噬潮。CK2依赖的S403磷酸化可促进神经母细胞瘤细胞中mHTT聚集体的清除。除S403外，在蛋白毒性应激下，ULK1在UBA结构域的S407位点发生特异性磷酸化。S407磷酸化使UBA二聚体界面不稳定，促进二聚体向单体转变，并暴露S403位点以进行进一步磷酸化，从而增加SQSTM1对泛素化蛋白的结合亲和力。S407磷酸化是S403磷酸化的前提。ALS相关的UBA结构域突变会减少S403和S407位点的磷酸化，从而阻碍蛋白质清除。此外，KIR结构域中S349位点的磷酸化虽然不直接参与自噬，但对KEAP1-NFE2L2通路具有调节作用。S349磷酸化由MTORC1、CK1、ULK1、PLK2（polo样激酶2）和PRKA/PKA（cAMP依赖性蛋白激酶）催化，增强SQSTM1与KEAP1的结合。S349磷酸化促进胞质SQSTM1体的形成及其对KEAP1的结合亲和力。在蛋白酶体应激下，T269/S272位点的磷酸化促进聚集体的形成，但抑制LC3与SQSTM1的结合及其自噬受体活性。这些磷酸化位点的修饰调节了SQSTM1在自噬中的货物识别、蛋白质清除和自噬降解功能。
与隔离的泛素连接：像其他翻译后修饰一样，SQSTM1的泛素化也能调节其功能。SQSTM1在UBA结构域内的K420位点被泛素化，这破坏了UBA结构域的二聚化，打开了闭合构象，从而增强了SQSTM1的隔离活性、其与多泛素化底物的相互作用以及随后与LC3的结合和自噬降解。UBE2D2和UBE2D3是介导该位点泛素化的E2酶，而KEAP1-CUL3作为E3泛素连接酶参与调控。相反，由USP8（泛素特异性肽酶8）催化的K420去泛素化会抑制自噬潮。此外，PB1结构域内的泛素化对SQSTM1在选择性自噬中的功能也至关重要。K7位点可被E3酶TRIM21泛素化，也可被USP13去泛素化。K7位点的泛素化破坏了PB1结构域的寡聚化，从而对自噬产生负面影响。E3连接酶NEDD4介导的泛素化对自噬和自噬体生物发生是必需的。TRIM44作为去泛素化酶，在氧化应激下介导PB1结构域依赖的SQSTM1寡聚化，并促进随后的S349磷酸化，改善SQSTM1-KEAP1相互作用，从而促进自噬。
乙酰化介导的SQSTM1活性调节：乙酰化涉及在赖氨酸残基上可逆添加乙酰基团，由赖氨酸乙酰转移酶介导，而去乙酰化由赖氨酸脱乙酰酶/组蛋白脱乙酰酶（KDAC/HDAC）介导。SQSTM1在UBA结构域的K420和K435位点发生乙酰化。乙酰化由TIP60/KAT5介导，去乙酰化由HDAC6介导。UBA结构域的乙酰化破坏了SQSTM1的自二聚化，增强了其与泛素化底物的结合，并促进SQSTM1体组装和相分离，从而增强多泛素化蛋白的清除。此外，K295位点的乙酰化增强了SQSTM1与KEAP1的相互作用，可能促进KEAP1-NFE2L2通路和自噬，而SIRT1去乙酰化作用则抑制这一过程。
脂肪酸锚：将SQSTM1系在自噬体上：S-酰化（通常称为棕榈酰化）是一种可逆的翻译后修饰，通过不稳定的硫酯键将长链脂肪酸（通常是棕榈酸）添加到半胱氨酸残基上。催化这一过程的酶称为棕榈酰基转移酶，其包含保守的锌结合DHHC（ZDHHC）基序。SQSTM1在C289和C290双半胱氨酸基序处发生S-酰化，该反应由ZDHHC19催化，并由APT1去酰化。活跃形式的SQSTM1发生S-酰化，这种修饰促进了SQSTM1对LC3的亲和力及其向自噬体的招募，从而增强依赖SQSTM1的自噬潮。此外，S-酰化对SQSTM1定位于溶酶体并伴随增加其溶酶体降解也很重要。在HD患者大脑和小鼠模型中，SQSTM1的S-酰化显著减少，这与自噬在货物装载步骤的失调有关。增强S-酰化可能改善HD中观察到的货物装载缺陷。
S-亚硝基化，另一种半胱氨酸修饰：S-亚硝基化涉及将亚硝基共价添加到半胱氨酸残基的反应性巯基上形成S-亚硝基硫醇（SNO）。SQSTM1在LIR基序内的C331位点发生S-亚硝基化（形成SNO-SQSTM1）。与S-酰化的SQSTM1类似，SNO-SQSTM1表现出与LC3结合增加。然而，SQSTM1的S-亚硝基化通过阻止自噬体和溶酶体的融合来抑制自噬潮。虽然这两种半胱氨酸修饰都增加了SQSTM1与LC3的结合，但它们对整体自噬潮的影响截然不同。SNO-SQSTM1可能竞争性地干扰PLEKHM1-LC3的相互作用，从而阻止自噬体-溶酶体融合。在路易体病（LBD）中，SNO-SQSTM1升高促进了SNCA作为细胞外囊泡的分泌，从而促进了SNCA的细胞间传播。
串扰：SQSTM1翻译后修饰如何协同工作：SQSTM1在UBA结构域的泛素化以结构域依赖的方式影响其磷酸化和随后的自噬降解。TRIM44介导的PB1结构域泛素化促进了SQSTM1寡聚化，从而增强S349磷酸化并激活抗氧化反应。棕榈酸（PA）的加入可通过抑制TRIM21的E3连接酶活性促进SQSTM1体的形成和隔离，增强PB1二聚化并增加S403磷酸化。当前磷酸化与泛素化之间串扰的研究最为深入，未来仍需探索其他修饰之间的相互作用机制（如S-酰化与S-亚硝基化在半胱氨酸残基上的竞争关系，以及泛素化与乙酰化在K420位点的协同或竞争作用），以全面理解SQSTM1在神经退行性疾病中介导自噬的调控机制。
