一种基于下一代测序技术的快速一步法系统，可整合微单倍型与SNP用于法医鉴定

《BMC Genomics》：A rapid one-step NGS-based system integrating microhaplotypes and SNPs for forensic identification

　　

摘要

由于部分STR位点的扩增子长度较长，且存在“ stutter”伪影，短串联重复序列（STRs）在分析复杂的法医样本时效果有限。而单核苷酸多态性（SNPs）因扩增子较短，更适用于降解严重的DNA分析；不过微单倍型（MHs）相比双等位基因SNPs，每个位点具有更高的等位基因多样性，从而提升了混合物分离分析的统计功效。为满足这些需求，我们开发了一种基于下一代测序（NGS）的MHs和SNPs检测系统，该系统包含24个MHs、80个SNPs以及一个Y-Indel标记。此外，我们还设计了一种快速的一步式文库制备方法——反向探针引导的直接扩增法。该方法通过在一个反应管中同时完成目标序列扩增和适配子连接，可在2.5小时内高效构建目标NGS文库，避免了中间转移带来的污染风险。我们进行了全面的法医验证，包括群体遗传学参数分析（总区分度为1–2.0265×10^–39）、严重降解DNA的分析性能（降解指数为10–15，通过qPCR测定；在已知受害者的1:9混合样本中，支持嫌疑人存在的概率比大于2.26×10¹⁵）、福尔马林固定石蜡包埋组织的分析性能（我们的检测体系实现了100%的基因分型准确率，而毛细管电泳-STR方法的等位基因丢失率超过38%）、物种特异性测试（六种常见的非人类物种：鸡、牛、猪、鼠、兔和羊，均未产生可解读的分型数据），以及抑制剂抗性测试（针对三种常见的法医抑制剂：不同浓度的腐殖酸、靛蓝和EDTA）。总体而言，这种一步式文库制备流程以及整合型的MH-SNP检测体系，为处理包括降解DNA、降解混合物、FFPE组织以及被抑制剂污染的样本在内的各类复杂法医样本中的个体识别提供了快速且可靠的方法。