将分散型液-液微萃取技术与HPLC-MS/MS结合，用于同时检测尿液中的烟草暴露生物标志物及神经发育相关代谢物

《Journal of Chromatography A》：Integrating Dispersive Liquid-Liquid Microextraction with HPLC-MS/MS for Simultaneously Determining Urinary Tobacco Exposure Biomarkers and Neurodevelopmental Metabolites

　　

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  一种用于检测21种尿液代谢物的新型单次运行UHPLC-HILIC-QqQ分析方法。
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  首次实现烟草成分、神经递质及氧化标志物的同步定量分析。
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  通过净化处理结合DLLME与UHPLC-HILIC-QqQ技术，可将尿液样本中的基质干扰降低至10%以下。
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  仅需1毫升尿液即可检测微量NNAL，且无需进行水解处理。
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  该技术可同时检测多种生物标志物，适用于大规模神经发育状况的监测。

引言

烟草烟雾暴露是全球重大的公共卫生问题，通过二手烟和三手烟影响全球约7亿儿童的健康[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。二手烟是指香烟燃烧端散发出的主流烟与侧流烟的混合物，而三手烟则是指残留在织物、表面及灰尘上的燃烧残留物，以及这些残留物与环境中的氧化剂发生反应后产生的化学物质[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]。

香烟烟雾是一种复杂的混合物，含有数千种有毒化合物，其中包括至少63种已知的致癌物质、亚硝胺、多环芳烃以及重金属[12]、[13]。最新研究显示，烟草烟雾暴露可导致细胞损伤、慢性炎症、氧化应激以及神经毒性，进而干扰儿童的神经发育过程[14]、[15]、[16]。神经递质是神经系统中的重要信号分子，能够调节细胞间通讯，并参与调控蛋白质、激素及其他生物活性物质的合成过程[17]、[18]。神经递质信号传导异常会促使活性氧的产生，这类物质会对DNA和RNA造成氧化损伤，进而可能加重神经和行为方面的问题[19]、[20]。这类氧化和神经化学层面的改变与神经发育障碍的风险增加密切相关，这类疾病包括自闭症谱系障碍、注意力缺陷/多动障碍以及发育性智力障碍，它们都是日益严重的公共卫生问题[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]。生命早期出现的神经化学失衡和氧化应激，可能会增加日后患阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病的风险[27]、[28]。由于婴儿和儿童的神经系统及其他器官仍在发育中，他们更容易受到这些因素的影响[16]、[29]、[30]、[31]。

在此背景下，开发一种高效且全面的分析方法，用于同时检测神经递质及其主要代谢物、氧化应激生物标志物以及烟草特异性代谢物，对于了解烟草烟雾在儿童神经发育关键时期如何引发长期神经功能异常和神经化学失衡具有十分重要的意义[32]。与血液或组织样本相比，尿液采样更为简便，且样本获取难度更低，因此非常适合用于儿童群体的无创生物监测[18]、[33]。此外，部分尿液生物标志物的半衰期相对较长，这也使得它们更适于用于暴露程度的评估[5]、[34]。然而，由于这些分析物的浓度较低、物理化学性质差异较大，再加上尿液基质较为复杂，往往会导致严重的离子抑制现象，因此实现它们的同步定量分析仍然面临很大挑战。

为了解当前研究的背景，我们对2005年至2025年间发表的基于液相色谱的分析方法进行了文献综述。符合筛选标准的25项研究（见表S1）从样品前处理方法、色谱条件以及分析性能（检测限和定量限）等方面进行了评估。常见的样品前处理技术包括液液萃取、QuEChERS法（一种快速、简便、成本低廉且高效的提取方法）、“稀释后直接分析”法、蛋白质沉淀法、过滤法、固相萃取以及固相微萃取。近年来，分散液液微萃取技术作为一种快速、经济且环保的替代方法逐渐被广泛应用，它能够在复杂基质中以较少的溶剂用量实现痕量分析[35]、[36]。该技术已被证明可用于检测尿液中的烟草生物标志物，其检测限很低，适合用于被动暴露程度的评估；同时也可通过基于液相色谱-质谱的技术，高灵敏度地检测单胺类神经递质及其相关代谢物[37]、[38]。

在色谱分离方面，反相液相色谱至今仍被广泛用于生物分析领域；不过，它在对高极性、低分子量的代谢物进行分析时存在局限性。因此，对于含有氨基的化合物，需要先进行衍生化处理；而对于高极性或酸性化合物，则需加入离子对试剂，这样才能提高保留时间、优化色谱分离效果，并提升方法的选择性和灵敏度[39]、[40]、[41]。相比之下，亲水作用液相色谱通过氢键和偶极-偶极相互作用来实现更好的保留效果，而酰胺结构也越来越常被用于极性代谢物的分析中[39]、[42]、[43]、[44]、[45]、[46]。

尽管在这些方法学方面取得了诸多进展，但目前还没有任何经过验证的分析方法能够实现在单次分析过程中，同时检测人类尿液样本中的神经递质、氧化应激生物标志物以及烟草相关代谢物（详细的文献检索结果及与已有方法的对比可见表S1）。为填补这一分析空白，本研究开发并验证了一种高通量的亲水作用液相色谱串联质谱分析方法，该方法结合了高效能的DLLME代谢物提取技术。我们还研究了是否可以通过添加净化步骤来减少基质干扰，提升不同结构类别分析物的提取效率，从而实现仅用1毫升尿液就能进行可靠的低浓度定量分析。该方法的目标分析物包括21种尿液代谢物，其中有三种烟草特异性暴露生物标志物（可替宁、反式-3’-羟基可替宁和NNAL），两种氧化应激生物标志物（8-氧代脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷），以及16种与单胺能系统、谷氨酸能系统和色胺能系统相关的神经递质及其代谢物（腺苷、邻苯二甲酸、多巴胺、肾上腺素、色胺酸、色胺、组胺、γ-氨基丁酸、谷氨酸、L-谷氨酰胺、褪黑素、去甲肾上腺素、喹啉酸、血清素、色氨酸和黄嘌呤酸）。

为验证该方法的实际应用价值，并评估其能否用于大规模生物监测研究，我们分析了部分有家庭烟草烟雾暴露史的儿童的尿液样本。这项初步应用旨在评估该方法在真实生物样本中的区分能力，同时探讨在不同烟草烟雾暴露水平的人群中，尿液中的烟草代谢物、氧化应激指标以及神经递质水平是否存在差异。

章节要点

化学品与试剂

所使用的烟草特异性代谢物及其标记化合物由加拿大的Toronto Research Chemicals公司提供，纯度均≥98%，具体包括：1-甲基-5-(吡啶-3-基)吡咯烷-2-酮（可替宁）、(±)-1-(甲基-d₃)-5-(2-吡啶基)-2-吡咯烷酮（可替宁-d₃）、4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇（NNAL）、4-(甲基-d₃-亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇（NNAL-d₃）、反式-3′-羟基-1-甲基-5-(吡啶-3-基)吡咯烷-2-酮（OH-可替宁），以及反式-3′-羟基-1-(甲基-d₃

结果与讨论

方法开发是通过分析未遭受烟草烟雾暴露的儿童的混合尿液样本来进行的，这些尿液样本中加入了所有目标分析物，浓度分别为10 ng/mL和500 ng/mL，共5份样本，样品的前处理则是按照2.2节所述的方法进行的。

结论

据我们所知，这项研究首次提出了一种经过全面验证的UHPLC–MS/MS分析方法，该方法可在单次色谱分析过程中同时检测人类尿液中的烟草特异性生物标志物、神经递质、相关代谢物以及氧化应激生物标志物。通过整合三类具有不同生物化学特性的代谢物，该方法克服了现有分析方法的局限性——那些方法都是分别针对每一类分析物进行检测的，因此无法全面反映实际情况。

CRediT作者贡献说明

Camilla Guerrini：负责原始稿件的撰写、正式分析、数据整理以及概念设计工作。Maria Vinaixa：负责稿件的审阅与编辑、项目监督以及概念设计工作。Noelia Ramirez：负责稿件的审阅与编辑、项目监督、项目管理工作以及资金筹集，同时还参与了概念设计工作。

利益冲突声明

所有作者声明，他们不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

本研究得到了“拉卡萨”基金会通过项目LCF/PR/SR19/52540002的支持，同时也得到了卡洛斯三世健康研究所的资助，此外还有欧盟通过NR的Miguel Servet项目（编号CP19/00060）以及CG的预博士项目（编号FI23/00032）提供的经费支持；加泰罗尼亚政府也通过项目2021-SGR-00741和2021-SGR-00842为该项目提供了资助，另外MCIN/AEI/10.13039/501100011033资助的项目PID 2020-114587GB-I00也为本研究提供了资金帮助。

Camilla Guerrini|Maria Vinaixa|Noelia Ramirez