《Journal of Food Composition and Analysis》：Derivatization-based fatty acid profiling as a promising approach for Oviductus Ranae authentication
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采用基于衍生化的脂肪酸（Fatty Acid，FA）分析方法来区分林蛙油（Oviductus Ranae，OR）与其伪品。样品用4-氨基-1-苄基哌啶（4-Amino-1-benzylpiperidine，4A1BP）衍生化，并通过超高效液相色谱-四极杆飞行时
采用基于衍生化的脂肪酸（Fatty Acid，FA）分析方法来区分林蛙油（Oviductus Ranae，OR）与其伪品。样品用4-氨基-1-苄基哌啶（4-Amino-1-benzylpiperidine，4A1BP）衍生化，并通过超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（Ultra-High-Performance Liquid Chromatography-Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry，UHPLC-Q-TOF MS）进行分析。共收集了30份来自东北林蛙（Rana dybowskii，中文名林蛙，LW）的OR样品和30份来自黑斑侧褶蛙（Pelophylax nigromaculatus，中文名青蛙，QW）的伪品样品，并按2:1的比例随机分为训练集和验证集。训练集的非靶向分析显示，LW和QW之间有56种化合物存在显著差异，其中35种为FA。基于液相色谱-质谱（LC-MS）获得的特征碎片，通过全球天然产物社会分子网络（Global Natural Products Social Molecular Networking，GNPS）和内部数据库检索，初步鉴定了53种FA。最后，根据信号强度选择了11种FA作为区分LW和QW样品的FA标记物。使用主成分分析-分类（PCA-Class）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型初步评估了这11种候选FA标记物区分LW和QW的分类性能。在有限的验证集中，PLS-DA模型正确分类了所有LW样品，表明在当前分析条件下这些标记物具有区分LW和QW的潜力。
林蛙油（Oviductus Ranae，OR）是东北林蛙（Rana dybowskii，简称LW）的输卵管制品，具有免疫调节、抗氧化、抗疲劳、抗衰老、抗肿瘤、抗炎和抗骨质疏松等多种生物活性，被用作珍贵药材和高档功能食品。由于市场需求大、价格高，常出现伪品，主要伪品为黑斑侧褶蛙（Pelophylax nigromaculatus，简称QW）、牛蛙（Rana catesbeiana）和黑眶蟾蜍（Duttaphrynus melanostictus）的输卵管，这些干制品在外观和形态上难以区分。现有鉴定方法如高效液相色谱（HPLC）蛋白指纹图谱易受加工和储存条件影响，DNA条形码和聚合酶链反应（PCR）等遗传检测技术准确但操作复杂、不适于大规模快速筛查。脂肪酸（Fatty Acid，FA）是OR中丰富的营养成分，其组成受物种遗传背景、代谢特征等因素影响，因此FA谱分析有望用于鉴别OR真伪。然而，传统FA液相色谱-质谱（LC-MS）分析存在电离效率低、标准品有限等问题。衍生化可提高FA的离子化效率并产生特征碎片，有利于鉴定。研究人员基于此，发展了基于衍生化的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF MS）方法，建立FA谱用于区分LW和QW。该研究发表在《Journal of Food Composition and Analysis》。
研究人员采用的关键技术方法包括：使用4-氨基-1-苄基哌啶（4A1BP）对样品中的FA进行衍生化，引入易质子化氮原子以提高在正离子电喷雾电离（ESI+）模式下的检测灵敏度，并产生特征碎片离子m/z 91和174。样品经乙腈提取后衍生化，采用UHPLC-Q-TOF MS分析，使用ACQUITY HSS T3色谱柱（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm），流动相为水（0.1%甲酸）和乙腈梯度洗脱。数据采集包括全扫描、数据非依赖采集（DIA，MSe模式）和数据依赖采集（DDA，fast-DDA模式）。数据处理使用Progenesis QI进行峰提取、对齐和归一化，多元统计分析使用SIMCA软件（主成分分析PCA、偏最小二乘判别分析PLS-DA），FA注释结合特征碎片、全球天然产物社会分子网络（GNPS）分子网络和自建数据库。样本来源：30份LW样品来自吉林省辉南县蛙场，30份QW样品来自重庆市云阳县蛙场，按2:1随机分为训练集（各20份）和验证集（各10份）。
研究结果如下：
3.1 LC-MS分析：通过比较两种色谱柱，选择HSS T3柱获得更好的峰容量和峰形。质量控制（QC）样本的PCA分析显示所有QC点聚集，且超过80%特征峰的相对标准偏差（RSD）低于30%，中位RSD为13.4%，表明方法重现性和仪器稳定性良好，确保谱图差异来自样品而非分析漂移。
3.2 化学标记物筛选和注释：训练集的PLS-DA模型显示LW和QW两组完全分离（R2X=0.761，R2Y=0.992，Q2=0.984），置换检验（n=200）无过拟合。以变量投影重要性（VIP）>1、错误发现率（FDR）校正p<0.05、倍数变化（FC）>1.5为筛选标准，得到56个化学标记物，其中35个为FA。通过精确质荷比、同位素分布、MS2信息与数据库匹配，结合GNPS分子网络，初步注释了这些标记物，包括溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）、磷脂酰胆碱（PC）和FA等。以LysoPC(18:1)和FA C20:1为例说明了注释过程，其特征碎片符合衍生化产物特征。
3.3 脂肪酸谱分析：基于衍生化FA的特征碎片（m/z 91和174），通过提取碎片、手动检查和GNPS分子网络三种方法，共提取了466个FA相关特征。层次聚类分析和PLS-DA（R2X=0.817，R2Y=0.982，Q2=0.977）显示LW和QW组基于FA谱可分离。通过GNPS分子网络和自建数据库，共初步注释了53种FA。进一步筛选出11种VIP>2、FC>2、p<0.05的FA作为候选标记物。热图显示LW中多不饱和脂肪酸（PUFA）如C18:3、C20:5、C22:6等含量较高，而QW中饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸（MUFA）含量较高。这11种FA的受试者工作特征曲线（ROC）下面积（AUC）均大于0.9，表明其区分性能良好。
3.4 使用选定FA标记物区分LW和QW：在验证集（各10份）中，使用11种FA标记物构建PCA-Class和PLS-DA模型。PCA-Class模型对LW预测准确率100%，但对QW准确率较低（敏感度70%，特异度30%，准确率50%）。PLS-DA模型则正确分类了所有20个样品，敏感度、特异度和准确率均达100%。但研究人员指出，由于验证集样本量小且多样性有限，该结果应视为初步结果，不能作为方法已完全验证的证据，需进一步使用更大、更多样化的独立样本集进行验证。
讨论部分：研究人员指出，非靶向分析显示脂质是OR的主要成分，FA是区分LW和QW的主要化学标记物。LW中PUFA含量高于QW，这可能与物种生殖生理差异有关，因为PUFA在胚胎发育、膜形成和细胞信号中起关键作用。此外，不同物种的摄食习性和营养利用差异也可能影响FA积累。与传统的气相色谱-质谱（GC-MS）相比，本衍生化UHPLC-Q-TOF MS方法具有快速衍生化（10分钟）、分析时间短（27分钟）等优势。三种数据采集方法（全扫描、DIA、DDA）的结合提高了FA注释的覆盖率和准确性。该方法还可与实时直接分析（DART）等环境电离技术结合，实现快速高通量分析。但研究存在局限性：未使用内标，提取回收率、基质效应和定量验证未系统评估；FA标记物为初步注释，双键位置、几何构型、氧化位点等未确定；样本量小，仅涉及一种伪品，地理来源、养殖条件等因素未排除。因此，方法的适用性需进一步验证。
结论翻译：研究人员开发了一种基于衍生化的FA分析方法，用于在当前条件下区分LW和QW。基于FA强度可将LW和QW分离。选择了11种初步注释的FA作为化学标记物，其在LW和QW组间的强度差异显著。使用PLS-DA模型初步评估了这些FA的区分能力，在有限的验证集上表现出良好的性能。在将该方法用于常规鉴定之前，需要利用更大、更多样化和独立的样本队列进行进一步验证。该方法有望更广泛地应用于不同食品基质中FA的分析。通过适当的基质特异性和定量验证，它可能为富含FA食品的质量评估和真实性研究提供有用的分析工具。
