不同儿茶素对冻藏期间牛肉肌原纤维蛋白特性的影响及构效关系

《Journal of Future Foods》：Effects and structure-activity relationship of different catechins on properties of myofibrillar protein from beef during frozen storage

　　

研究人员研究了不同结构儿茶素对冻藏期间肌原纤维蛋白（myofibrillar protein，MP）特性的影响及构效关系。儿茶素包括表儿茶素（epicatechin，EC）、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）、表儿茶素-3-没食子酸酯（epicatechin-3-gallate，ECG）和表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）能够降低MP的粒径和溶解度，增加其表面电荷和疏水性，并抑制蛋白质解折叠和聚集。同时，儿茶素降低了MP的羰基、游离氨基和游离巯基含量，抑制了冻融循环过程中MP的氧化损伤。此外，儿茶素改善了冻融循环后MP凝胶的理化性质。多光谱分析和分子对接表明，儿茶素通过氢键和疏水相互作用等强相互作用显著改变了MP的二级和三级结构，作用顺序为：EGCG > ECG > EGC > EC。这些结果表明，结构特征如羟基的数量和位置以及分子中没食子酰基的存在，显著影响了儿茶素对冻藏期间MP结构和性质的作用。位于B环5′-位的羟基和连接在C环3-位的没食子酰基在儿茶素与MP的分子相互作用中发挥了重要作用，这有助于其高偶极矩和与MP的强结合亲和力。所有结果表明，含有没食子酰基的儿茶素（ECG和EGCG）比缺乏没食子酰基的儿茶素（EC和EGC）在改善冻藏期间MP性质方面表现出更强的能力。

**论文解读文章**

牛肉作为高品质动物源性食品，富含蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素和矿物质，但在运输和长期储存中易变质。冷冻是常用的保鲜方法，然而冷链运输、零售和家庭消费中的温度波动导致反复冻融。冻融过程中冰晶反复形成，对肌肉组织施加机械应力，损伤肌纤维和细胞结构，破坏肌原纤维蛋白（myofibrillar protein，MP）的天然构象，引发不溶性聚集和氧化共价修饰，导致肉制品风味、质地、颜色和营养价值劣化。合成食品添加剂虽能抑制这些变化，但其潜在毒性引发公众担忧，因此植物源天然物质成为替代方向。儿茶素（catechins）是绿茶主要活性成分，具有抗氧化、抗菌等活性，常见的包括表儿茶素（epicatechin，EC）、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）、表儿茶素-3-没食子酸酯（epicatechin-3-gallate，ECG）和表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）。先前研究发现茶多酚能改善冻藏期间牛肉品质，可能归因于儿茶素与MP的相互作用。由于茶多酚是多种结构不同的儿茶素混合物，研究人员假设不同结构的儿茶素对MP具有不同的结合亲和力，从而对冻藏期间牛肉品质产生不同程度的改善。因此，本研究旨在探究四种结构不同的儿茶素对冻藏条件下MP结构完整性和功能行为的影响，通过多光谱分析和分子对接揭示构效关系，并评估其对MP凝胶形成能力的增强效果。该研究为减轻反复冻融引起的品质劣变提供理论依据，并支持天然抗氧化剂在冷冻肉制品中的应用。论文发表在《Journal of Future Foods》。

**关键技术方法**（不超过250字）：样本来源为新鲜牛肉里脊（购自中国成都超市）。主要技术方法包括：MP的提取与浓度测定（双缩脲法）；粒径分布和Zeta电位测定；溶解度和表面疏水性测定（溴酚蓝结合法）；羰基含量测定（2,4-二硝基苯肼（DNPH）法）、游离氨基含量测定（邻苯二甲醛（OPA）法）、游离巯基含量测定（5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）法）；傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析；内源荧光光谱和三维荧光光谱分析；分子静电势（MEP）计算（Gaussian软件，B3LYP/6-311+G(d,p)）；分子对接（CDOCKER程序，使用牛肌球蛋白同源模型）；凝胶性质测定包括质构分析（TPA）、保水性（WHC）、流变学特性（温度扫描、应变扫描、频率扫描）和热稳定性（热重分析（TGA））。所有实验重复三次，数据以均值±标准差表示，采用SPSS 20.0进行单因素方差分析（ANOVA）和Tukey检验（P<0.05）。

**研究结果**：

**3.1 冻藏期间不同儿茶素对MP的粒径和Zeta电位的影响**：通过粒径分布和Zeta电位测定发现，儿茶素降低了MP的粒径并使分布更窄，增加Zeta电位绝对值，增强静电排斥，抑制聚集。含没食子酰基的ECG和EGCG效果强于不含的EC和EGC，且B环5′-位酚羟基也增强抑制能力。

**3.2 冻藏期间不同儿茶素对MP的溶解度和表面疏水性的影响**：通过溶解度和表面疏水性测定发现，儿茶素降低了MP溶解度，增加了表面疏水性。ECG和EGCG通过氢键和疏水相互作用（其没食子酰基提供）效果更强，抑制聚集。

**3.3 冻藏期间不同儿茶素对MP的羰基、游离氨基和游离巯基含量的影响**：通过羰基（DNPH法）、游离氨基（OPA法）和游离巯基（DTNB法）测定发现，儿茶素降低了这些氧化指标含量，抑制MP氧化损伤。ECG和EGCG通过没食子酰基清除自由基效果更显著，但其氧化产物醌类与氨基和巯基共价加成，导致游离氨基和游离巯基进一步降低。

**3.4 冻藏期间不同儿茶素对MP的傅里叶变换红外光谱的影响**：通过FTIR分析发现，儿茶素增加了MP的β-折叠含量，降低了β-转角含量，而α-螺旋和无规卷曲变化不大，表明促进了更有序的构象状态。含三羟基苯基的EGC和EGCG效果更强。

**3.5 冻藏期间不同儿茶素对MP的荧光光谱的影响**：通过内源荧光和三维荧光光谱分析发现，儿茶素以静态猝灭为主（结合动态猝灭）猝灭MP荧光，猝灭常数顺序为EGCG > ECG > EGC > EC。结合常数和结合位点分析表明至少存在一个主要结合位点，形成1:1复合物。热力学参数显示，EC和EGC与MP结合主要由静电相互作用驱动，而ECG和EGCG主要由范德华力和氢键驱动。三维荧光显示儿茶素引起MP蛋白骨架和侧链微环境变化。

**3.6 分子间相互作用**：通过分子静电势（MEP）计算和分子对接发现，儿茶素偶极矩顺序为EGCG > ECG > EGC > EC，表明更多酚羟基和没食子酰基增加分子极性。分子对接显示儿茶素与牛肌球蛋白主要通过氢键和疏水相互作用结合，作用能顺序为EGCG > ECG > EGC > EC，表明含没食子酰基的儿茶素结合更强。

**3.7 冻藏期间不同儿茶素对MP凝胶性质的影响**：
**3.7.1 质构特性和保水性**：通过质构分析（TPA）和保水性（WHC）测定发现，儿茶素提高了MP凝胶的硬度、胶黏性和保水性，ECG和EGCG效果更优，归因于更强的氢键和疏水相互作用形成更致密的凝胶网络。
**3.7.2 流变学特性**：通过温度扫描、应变扫描和频率扫描发现，儿茶素增加了MP凝胶的储能模量（G^′）和损耗模量（G^″），ECG和EGCG效果更强，表明促进了更紧密的交联网络。所有凝胶的tanδ大于1，黏性行为占主导。
**3.7.3 热稳定性**：通过热重分析（TGA）发现，儿茶素提高了MP凝胶的分解峰值温度和最大分解速率，增加了质量损失率，ECG和EGCG效果更强，表明形成了更稳定的凝胶网络。

**总结讨论**：讨论部分综合各结果指出，儿茶素通过氢键和疏水相互作用与MP结合，改变其二级和三级结构，抑制冻融过程中的氧化和聚集，并改善凝胶性质。含没食子酰基的ECG和EGCG因具有更高的偶极矩和结合亲和力，效果显著优于EC和EGC。B环5^′-位酚羟基和C环3-位没食子酰基是决定构效关系的关键结构。

**研究结论翻译**：在本研究中，四种儿茶素（EC、EGC、ECG和EGCG）在冻藏期间改善了MP的空间结构和理化性质，这归因于儿茶素与肌原纤维蛋白（MP）之间的相互作用，包括氢键和疏水相互作用。此外，ECG和EGCG表现出比EC和EGC更强的能力。在冻藏期间，与EC和EGC相比，ECG和EGCG在降低MP中羰基、游离氨基和游离巯基含量方面表现出显著更高的效率。此外，儿茶素能够改善MP凝胶的凝胶特性，作用强度顺序为：EGCG > ECG > EGC > EC。所有这些结果表明，儿茶素的结构特征，如酚羟基的数量和位置以及没食子酰基的存在，显著影响了其对冻藏期间MP结构和性质的作用。位于B环5^′-位的酚羟基和连接在C环3-位的没食子酰基在儿茶素与MP的分子相互作用中发挥了重要作用。然而，MP对儿茶素结构和功能的影响尚未确定，儿茶素的生物利用度也未评估。在未来的研究中，将优化冻藏期间儿茶素在MP和肉制品中的强化参数，并评估强化儿茶素的肉制品的感官和消化特性。