亚麻籽来源的环状亚麻肽J通过抑制NF-κB/NFATc1/ROS通路抑制炎症性骨丢失

《Journal of Future Foods》：Flaxseed-derived Cyclolinopeptide J inhibits inflammatory bone loss by suppressing the NF-κB/NFATc1/ROS pathway

　　

过度的破骨细胞生成是炎症性骨丢失的核心驱动因素，然而目前的治疗方法常因长期安全性问题而面临局限，凸显了对更安全、更具生物相容性的替代品的迫切需求。为应对这一挑战，本项研究确定了环状亚麻肽J（CLJ），一种来自老化亚麻籽油的环状肽，作为破骨细胞生成的有效抑制剂，它双重调节炎症和氧化应激。体外研究表明，CLJ抑制了破骨细胞分化，表现为TRAP活性降低、足体环（podosome belt）形成破坏以及骨吸收功能受损。机制上，CLJ减少了RANKL诱导的Ca2?振荡和关键破骨细胞生成转录因子（c-Fos和NFATc1）的表达，同时增强Nrf2活性以降低细胞内ROS水平并缓解氧化应激。Western blot和免疫染色结果证实，CLJ抑制了RANKL介导的NF-κB信号通路。此外，分子对接、动力学模拟和表面等离子共振（SPR）揭示，CLJ可能直接结合RANKL，从而抑制RANK-RANKL相互作用及下游NF-κB激活。在LPS诱导的炎症性骨丢失小鼠模型中，CLJ有效减轻了骨丢失并恢复了骨小梁结构。综合来看，这些发现确立了CLJ作为一种食物来源的生物活性肽，通过NF-κB/NFATc1/ROS信号网络抑制破骨细胞分化，从而改善炎症性骨丢失。

**论文解读：亚麻籽环肽CLJ通过NF-κB/NFATc1/ROS通路抑制炎症性骨丢失**

**研究背景与问题**

骨稳态依赖于成骨细胞骨形成与破骨细胞骨吸收之间的动态平衡。当这一平衡被打破，尤其是破骨细胞过度活化时，会导致病理性骨丢失。慢性炎症是骨溶解性疾病（如炎性骨破坏、类风湿关节炎和牙周炎）的关键病理因素，其通过上调促炎细胞因子协同驱动破骨细胞分化和功能。目前临床治疗骨丢失的药物（如双膦酸盐和地诺单抗）虽有效，但长期使用常伴随严重副作用，如颌骨坏死和胃肠道毒性。因此，迫切需要开发能够特异性靶向炎症微环境、具有良好生物相容性的天然化合物来缓解病理性骨吸收。近年来，食物来源的生物活性肽（如大西洋鳕鱼肽和磷酸化肽）在通过调节破骨细胞生成通路预防骨丢失方面显示出潜力，但大多数常规线性肽因易被胃肠道酶解、膜通透性差及需要较高有效剂量而限制了实际应用。因此，发现具有高结构稳定性的天然食物肽仍是一项重大挑战。

亚麻籽（Linum usitatissimum L.）是重要的油料作物。亚麻籽油中的环状亚麻肽（Linusorbs, LOs）是一类疏水性环状肽，具有独特的头尾环状骨架，赋予其高稳定性、抗水解性和多种生物活性（如抗炎和免疫抑制）。在老化或氧化亚麻籽油中，主要LO（CLE）的氧化形式CLJ（含甲硫氨酸砜MetO₂）可积累至较高浓度。研究人员此前发现CLJ促进MC3T3-E1细胞成骨分化，且鉴于LOs的抗炎潜力，假设CLJ可能对炎症诱导的破骨细胞生成具有保护作用，但其机制尚不明确。

**研究内容与意义**

本研究系统评估了CLJ在体外抑制破骨细胞生成的效力，并在LPS诱导的炎症性骨丢失小鼠模型中验证其预防骨丢失的能力。通过生物物理测定和分子信号分析，证实CLJ通过破坏NF-κB/NFATc1/ROS信号轴抑制破骨细胞分化。结果表明，CLJ是一种新型食物来源的活性剂，可缓解炎症性骨溶解，突出了其作为骨健康功能膳食补充剂的潜在应用。该论文发表在《Journal of Future Foods》。

**主要关键技术方法**

研究人员从老化亚麻籽油中提取并纯化CLJ，采用高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS/MS）鉴定结构。体外实验使用RAW 264.7细胞和骨髓巨噬细胞（BMMs，来源：暨南大学医学院），通过TRAP染色、羟磷灰石吸收实验、鬼笔环肽染色评估破骨细胞分化和骨吸收功能。机制研究采用Western blot、免疫荧光、实时定量PCR（qRT-PCR）、Ca²⁺振荡分析、活性氧（ROS）检测。分子对接和分子动力学模拟用于预测CLJ与RANKL的结合，表面等离子共振（SPR）验证结合亲和力。体内采用LPS诱导的C57BL/6小鼠炎症性骨丢失模型（小鼠来源：广东维通利华动物技术有限公司），通过Micro-CT、组织学（H&E、TRAP染色）和血清生化分析评估效果。

**研究结果**

**3.1 CLJ在冷压亚麻籽油加速氧化过程中的浓度变化**：在60°C和120°C加速氧化条件下，CLJ浓度逐渐升高，60°C第50天达567.0 μg/g，120°C第12小时达562.5 μg/g。老化油中CLJ占提取粗LOs的56.2%。

**3.2 CLJ在体外抑制破骨细胞分化和骨吸收**：CLJ浓度≤10 μM对RAW 264.7细胞无显著毒性，并剂量依赖性地抑制RANKL诱导的破骨细胞形成（10 μM时破骨细胞面积和数量减少90%），减少羟磷灰石吸收面积（5 μM和10 μM分别减少54%和76%），破坏肌动蛋白环（podosome belt）完整性。在BMMs中同样验证了抑制效果。

**3.3 CLJ减弱Ca²⁺振荡和破骨细胞生成基因表达**：10 μM CLJ抑制RANKL诱导的Ca²⁺振荡强度约50%，并下调破骨细胞标志基因（TRAP、Atp6v0d2、Cathepsin K、RANK、NFATc1、c-Fos、NF-κB）的mRNA表达水平。

**3.4 CLJ抑制关键转录因子的激活**：Western blot显示CLJ在第2天显著降低NFATc1和c-Fos蛋白表达（分别减少21%和45%），第3天降低Cathepsin K表达67%。免疫荧光证实CLJ剂量依赖性地抑制NFATc1核转位（10 μM时荧光强度降低70.1%）。

**3.5 CLJ抑制NF-κB信号通路**：CLJ抑制IκB-α降解和磷酸化，减少p65磷酸化，并抑制p65核转位（10 μM时核p65表达降低69%）。时间动力学分析显示CLJ在10分钟后开始发挥抑制作用。

**3.6 CLJ结合RANKL并可能干扰受体激活**：分子对接预测CLJ与RANKL结合能为-6.419 kcal/mol，形成四个氢键。分子动力学模拟显示CLJ增加RANKL-RANK复合物的均方根偏差（RMSD）和回转半径（RoG），MM-GBSA计算结合能降低41.17%。SPR证实CLJ与RANKL直接结合，平衡解离常数（K_D）为5.31 μM。

**3.7 CLJ抑制破骨细胞生成过程中的ROS产生**：CLJ处理使DCF荧光强度降低92%，恢复至对照组水平，同时上调Nrf2活性（10 μM时Nrf2荧光强度增加2.91倍）。

**3.8 CLJ减轻炎症性骨丢失小鼠模型的骨丢失**：Micro-CT显示CLJ（20 mg/kg）显著提高骨密度（BMD增加1.4倍）、骨体积分数（BV/TV增加3.5倍）、骨表面积体积比（BS/TV增加2.4倍），并降低骨小梁间隙（Tb.Sp）。组织学H&E和TRAP染色证实CLJ改善骨小梁结构、抑制TRAP活性。血清中促炎细胞因子（IL-6、TNF-α）和骨吸收标志物（TRAP、CTSK）水平降低。肝肾脏H&E染色未见明显损伤，初步提示生物安全性。

**总结讨论与结论**

讨论部分指出，环状肽相比线性肽具有更高的稳定性和生物活性。CLJ作为老化亚麻籽油中的环状肽，通过结合RANKL抑制RANK-RANKL相互作用，进而抑制NF-κB通路激活，减少下游c-Fos和NFATc1表达，同时通过Nrf2增强抗氧化能力、清除ROS、抑制Ca²⁺振荡，从而全面抑制破骨细胞分化。体内实验验证了CLJ预防炎症性骨丢失的效果，且未观察到明显毒性。研究结论翻译如下：**结论**：本研究表明，来自老化亚麻籽油的环状肽CLJ通过NF-κB/NFATc1/ROS通路有效抑制破骨细胞生成并减轻炎症性骨丢失。计算机模拟和SPR结果显示，CLJ结合RANKL，破坏RANKL-RANK相互作用，抑制下游NF-κB信号，进而抑制主转录因子NFATc1和c-Fos的激活。此外，CLJ抑制Ca²⁺振荡，并通过上调Nrf2清除ROS来缓解氧化应激，进一步削弱破骨细胞分化和功能。在体内，CLJ干预有效预防了小鼠炎症性骨小梁丢失，且未检测到系统性毒性。这些发现不仅将CLJ确定为改善炎症性骨溶解的有前景的候选分子，也验证了回收老化亚麻籽油作为高价值生物活性肽的可持续来源。