《Journal of Future Foods》：Deciphering the Reversible Adaptation of PK15 Cells to Serum-Free Suspension Culture: A Stepwise Strategy and Molecular Insights
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摘要：培养肉的工业化迫切需要建立可扩展的种子细胞扩增平台。然而，培养肉生产中常用的贴壁细胞在适应无血清悬浮培养时面临巨大挑战。在本研究中，研究人员使用具有培养肉应用潜力的猪肾上皮细胞系PK15，系统比较了顺序降低和直接降低血清的策略，发现顺序降低血清在驯化贴壁
摘要：培养肉的工业化迫切需要建立可扩展的种子细胞扩增平台。然而，培养肉生产中常用的贴壁细胞在适应无血清悬浮培养时面临巨大挑战。在本研究中，研究人员使用具有培养肉应用潜力的猪肾上皮细胞系PK15，系统比较了顺序降低和直接降低血清的策略，发现顺序降低血清在驯化贴壁PK15细胞适应低血清培养条件方面更有效，能够维持细胞强劲增殖、正常的细胞周期进程和稳定的上皮表型。在此基础上，通过逐步降低血清，研究人员进一步将低血清贴壁PK15细胞适应为无血清悬浮培养，并显示出向更节能代谢状态的趋势。重要的是，这些适应细胞保留了部分表型可逆性。当返回贴壁培养条件时，适应细胞在形态、增殖相关表型和氧化应激相关指标方面普遍表现出向亲本贴壁细胞状态的明显恢复。转录组分析显示，在贴壁-悬浮-再贴壁转变过程中具有可逆表达模式的基因主要富集在细胞黏附和代谢调控通路中，表明细胞适应和恢复过程中黏附和代谢相关程序的可逆重塑。总体而言，本研究为PK15细胞建立了一种有效且稳定的无血清悬浮培养策略，并为培养肉研究中贴壁种子细胞的悬浮适应提供了方法学框架和宝贵参考。
**论文解读：PK15细胞无血清悬浮培养的可逆适应性研究**
**研究背景与问题**
培养肉作为细胞农业的核心分支，旨在通过体外细胞培养生产肉类，以缓解传统畜牧业带来的资源消耗、温室气体排放和动物福利等问题。然而，培养肉的工业化面临种子细胞扩增的瓶颈。目前常用的种子细胞，如间充质干细胞（MSCs）、肌肉卫星细胞（MuSCs）和诱导多能干细胞（iPSCs），多为贴壁依赖性生长，依赖二维（2D）培养系统，存在生长面积有限、体积产率低、传质效率不足以及关键参数（如溶解氧DO、pH）调控困难等问题。血清饥饿和悬浮培养是解决这些问题的关键，但从贴壁到悬浮的转变过程中，直接降低血清常导致细胞活力下降、增殖能力受损和代谢紊乱。因此，需要建立一种有效的逐步适应策略，并揭示其分子机制，以推动培养肉种子细胞的规模化扩增。
**研究内容与结论**
本研究以猪肾上皮细胞系PK15（具有培养肉应用潜力）为模型，系统比较了顺序降低血清与直接降低血清两种策略对贴壁细胞适应低血清培养的影响。结果表明，顺序降低血清策略在维持细胞增殖活性、细胞周期进程和上皮表型稳定性方面更优，能更有效地使细胞适应1%血清条件。在此基础上，研究人员通过逐步降低血清（1%→0.5%→无血清）并筛选合适的培养基（17020 SFM），成功建立了稳定、长期（至少45代）的无血清悬浮培养系统。适应后的细胞表现出代谢活性降低的趋势，葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺消耗和氨生成均减少，提示向更节能的代谢状态转变。更重要的是，这些悬浮适应细胞在重新回到贴壁培养条件后，能够快速恢复典型的贴壁形态、增殖能力和上皮表型，表现出部分表型可逆性。转录组分析显示，在贴壁-悬浮-再贴壁的连续状态转变中，细胞经历了广泛的转录组重塑，可逆表达的基因主要富集在细胞黏附（如ECM-整合素-黏着斑通路）和代谢调控（如谷胱甘肽代谢、Ras信号）相关通路中。蛋白水平验证表明，黏着斑激酶（FAK）的磷酸化水平在悬浮培养中显著降低，在再贴壁后部分恢复，进一步支持了细胞黏附通路的可逆调控。
**论文发表的期刊**
本研究论文发表在《Journal of Future Foods》。
**主要关键技术方法**
研究人员使用PK15细胞（来源于中国科学院细胞库）作为模型。主要技术方法包括：顺序降低血清策略与直接降低血清策略的比较；EdU增殖实验评估DNA合成能力；实时定量PCR（qPCR）检测增殖相关基因（MKi67、PCNA、CDK4、CCNB1）和黏附相关基因表达；Western blot检测细胞角蛋白（Cytokeratin-Pan）和FAK磷酸化水平；细胞代谢分析（葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、氨）评估代谢状态；流式细胞术分析细胞周期分布、线粒体膜电位（MMP，JC-1染色）和活性氧（ROS）水平；转录组测序（RNA-seq）及生物信息学分析（GO、KEGG通路富集）揭示可逆基因表达模式。
**研究结果**
**3.1 顺序降低血清是建立PK15细胞无血清悬浮适应更有效的策略**
通过比较顺序降低和直接降低血清两种策略，研究人员发现，顺序降低血清（从10%逐步降至1%）在约18代后获得稳定增殖的1%血清适应细胞，且生长曲线更平滑，最终细胞密度与对照组相当；而直接降低血清在1%血清组导致显著生长抑制和细胞密度下降。因此，顺序降低血清是更优的起始适应策略。
**3.2 顺序降低血清保留PK15细胞的增殖活性和表型稳定性**
EdU实验显示，顺序降低血清组中EdU阳性细胞比例稳定（33-38%），仅25%CGM+75%SFM组略有下降，而直接降低血清组中S期进入严重受损。基因表达分析表明，顺序降低血清维持了MKi67、PCNA、CDK4表达，但CCNB1在10%CGM+90%SFM阶段下降；直接降低血清则导致所有增殖基因下调。细胞角蛋白（Cytokeratin-Pan）表达在顺序降低血清中稳定或上调，表明上皮表型保留。
**3.3 建立稳定的PK15细胞无血清悬浮培养系统**
筛选培养基后，17020 SFM+1%FBS+Pluronic F-68+抗聚集试剂支持最佳单细胞分散和增殖。采用顺序降低血清（1%→0.5%→无血清）结合反复传代和TrypLE解离，成功建立无血清悬浮培养系统。适应后的细胞（SFM++（Sequential））可稳定培养至少135天（45代），细胞活力维持在85-95%。代谢分析显示，随着血清降低，葡萄糖消耗、乳酸积累、谷氨酰胺利用和氨生成均延迟或减少，提示向节能代谢状态转变。
**3.4 验证再贴壁培养后细胞表型的可逆性和稳定性**
将无血清悬浮适应细胞（SFM（SU））重新接种到含10%FBS的贴壁培养基中，细胞在P1即恢复典型上皮形态，并保持稳定增殖能力。增殖相关基因表达（MKi67、PCNA、CDK4）在再贴壁后恢复至对照水平，CCNB1表达也部分恢复。细胞角蛋白表达在再贴壁后显著升高，与对照组无显著差异，表明上皮表型可逆。
**3.5 悬浮适应和再贴壁过程中的可逆细胞状态转变**
细胞周期分析显示，所有组细胞周期分布稳定，仅1%FBS（AD）组G1期比例略有升高。线粒体膜电位（MMP）和活性氧（ROS）水平在各组间无显著差异，表明细胞在适应过程中维持了生理稳态。
**3.6 PK15细胞在无血清悬浮适应和再贴壁恢复中的转录组特征**
RNA-seq分析显示，悬浮适应组（SFM（SU））与贴壁对照组（CGM）相比有2521个差异表达基因（DEGs），再贴壁恢复组（CGM（BA））与SFM（SU）相比有2414个DEGs。聚类分析识别出两种可逆表达模式：高-低-高（H-L-H）模式（下调再上调）和低-高-低（L-H-L）模式（上调再下调）。KEGG和GO富集分析表明，H-L-H基因富集于黏附相关通路（ECM-受体相互作用、黏着斑），L-H-L基因富集于代谢和应激反应通路（谷胱甘肽代谢、Ras信号）。进一步验证发现，代表ECM-整合素-黏着斑的基因（如FN1、ITGB1、PTK2）呈H-L-H模式，而代谢相关基因（如GSTA1、HSD11B1）呈L-H-L模式。蛋白水平证实FAK磷酸化在悬浮培养中降低，再贴壁后部分恢复。
**总结讨论与结论翻译**
**讨论总结**
本研究系统比较了顺序降低与直接降低血清策略，证实顺序降低能更有效维持PK15细胞增殖、细胞周期和表型稳定性。通过逐步降低血清和筛选培养基，成功建立了无血清悬浮培养系统，适应细胞表现出节能代谢状态和部分表型可逆性。转录组分析揭示可逆基因表达主要涉及细胞黏附和代谢调控通路，提示适应过程是结构重塑和功能适应的有序整合。与以往研究相比，本研究建立了覆盖低血清贴壁、无血清悬浮和再贴壁恢复的连续实验框架，并扩展到表型可逆性、代谢适应和转录组重塑，拓宽了对贴壁细胞生长模式转换的理解。但该策略在培养肉常用种子细胞（如肌母细胞、间充质干细胞）中的普适性仍需验证，且表型可逆性不等同于长期遗传稳定性，需进一步评估核型、致瘤性等安全性指标。
**结论翻译**
在本研究中，研究人员建立了一种高效的顺序降低血清策略，使PK15细胞适应低血清贴壁培养，该策略在保留细胞增殖、正常细胞周期进程和稳定上皮表型方面优于直接降低血清。在此基础上，以17020 SFM为最优培养基，进一步建立了稳定的PK15细胞无血清悬浮培养系统。适应细胞能够在无血清条件下维持稳定悬浮生长，并连续传代超过40代，同时保持稳定的细胞活力和相对较低的代谢活性。值得注意的是，悬浮适应的PK15细胞表现出部分表型可逆性，在再贴壁后部分恢复亲本贴壁细胞的特征。进一步转录组分析揭示，PK15细胞在贴壁生长、无血清悬浮适应和再贴壁恢复的连续状态转变中经历了系统的转录组重塑，这些变化主要与细胞黏附和代谢调控相关通路有关，并表现出明显的环境依赖性和可逆性。总体而言，本研究为培养肉生产中种子细胞的可扩展无血清悬浮培养提供了潜在的技术框架和参考。
