利用计算机模拟方法结合体外抗菌活性分析研究芹菜素（APGN）对金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）的抗菌效果

《Kuwait Journal of Science》：Anti- Staphylococcus aureus effectiveness of apigenin using in silico method combined with in vitro antibacterial activity analysis

　　

摘要
金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）是一种对多种抗生素耐药的细菌病原体，亟需开发替代治疗策略。芹菜素（APGN）已显示出抗菌功效。本研究旨在通过计算机模拟（*in silico*）建模和体外（*in vitro*）验证，评估APGN与抗生素相比对金黄色葡萄球菌的抗菌效果。研究人员通过分子对接和分子动力学（MD）模拟，探索了五个重要的金黄色葡萄球菌靶点，即分选酶A/B（Sortase A/B）、青霉素结合蛋白（PBP1b）、PASTA结构域和外毒素（3URY）。还计算了相互作用能（IE）分析和分子力学/泊松-玻尔兹曼表面积（MM-PBSA）。使用SwissADME、ADMETLab 3.0和STop-Tox比较了APGN和头孢噻肟（CFTX）的药代动力学和毒性模式。采用抑菌圈直径（ZDI）测试了APGN对三种临床金黄色葡萄球菌菌株（LMEM-2501、LMEM-2502和LMEM-2503）的体外抗菌效果。APGN单独使用及与CFTX/阿米卡星（AMKC）联合使用。进一步测定了最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC），以及72小时生物膜抑制研究。APGN与常规抗生素表现出协同组合作用，ZDI值范围为7 mm至25 mm。APGN对金黄色葡萄球菌目标菌株的MIC分别为100 μg/ml、175 μg/ml和150 μg/ml。类似地，APGN对LMEM-2501的MBC为125 μg/ml，对LMEM-2502和LMEM-2503的MBC为175 μg/ml。APGN表现出统计上显著的、浓度依赖性的抗生物膜功效，对金黄色葡萄球菌的抑制率高达80.77%。尽管当前研究证明了APGN对金黄色葡萄球菌的抗菌和生物膜抑制功效，但在APGN被用作处方药之前，仍需进行体内（*in vivo*）验证和临床试验。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**
金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）是一种革兰氏阳性球菌，作为机会性病原体，可引发从医院获得性感染到社区获得性感染的多种疾病，包括菌血症、感染性心内膜炎、皮肤软组织感染、肺炎、中毒性休克综合征等。该病原体被世界卫生组织（WHO）列为优先病原体，因其对多种抗生素（如青霉素、甲氧西林、万古霉素）产生耐药性，导致治疗失败率上升。耐药机制包括药物靶点改变、酶促药物失活、外排泵增强等。当前抗生素耐药性形势严峻，亟需开发替代疗法。植物化学物质如芹菜素（APGN）——一种天然黄酮类化合物，广泛存在于洋甘菊茶、陈皮、柴胡等中药中，已被报道具有广谱抗菌活性，包括对耐药金黄色葡萄球菌。然而，以往研究多侧重于单一靶点的计算机模拟（*in silico*）预测或单独的体外（*in vitro*）抗菌实验，缺乏将多靶点计算机模拟评估与体外抗菌、杀菌、协同及抗生物膜特性相结合的综合分析。

**研究目的与意义**
本研究旨在填补上述知识空白，通过整合多靶点分子对接、100纳秒分子动力学（MD）模拟、相互作用能（IE）分析、分子力学-泊松-玻尔兹曼表面积（MM-PBSA）结合自由能计算、ADMET预测、毒性评估以及体外抗菌活性评价（包括协同测试、最低抑菌浓度（MIC）、最低杀菌浓度（MBC）和生物膜抑制实验）及统计分析，系统评估APGN对金黄色葡萄球菌的抗菌作用机制和效果。该研究首次将多靶点计算机模拟与体外验证相结合，为APGN作为抗耐药金黄色葡萄球菌的植物化学先导化合物提供了科学依据。论文发表在《Kuwait Journal of Science》。

**主要关键技术方法**
研究人员采用以下关键技术：
1. **计算机模拟方法**：使用AutoDock Vina驱动的CB-Dock2工具进行分子对接，评估APGN与五个金黄色葡萄球菌靶蛋白（分选酶A（Sortase A，PDB ID: 1T2P）、分选酶B（Sortase B，PDB ID: 1NG5）、外毒素（PDB ID: 3URY）、PASTA结构域（PDB ID: 7O4C）、青霉素结合蛋白1b（PBP1b，PDB ID: 2Y2P））的结合亲和力。利用Gromacs 2020.4软件进行100 ns分子动力学（MD）模拟，分析蛋白质-配体复合物的稳定性、均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）、溶剂可及表面积（SASA）和回转半径（Rg）。采用线性相互作用能（LIE）方法和MM-PBSA计算结合自由能。使用SwissADME、ADMETLab 3.0和STop-Tox预测药代动力学和毒性。
2. **体外实验方法**：采用纸片扩散法测定抑菌圈直径（ZDI），对三种临床金黄色葡萄球菌菌株（LMEM-2501、LMEM-2502、LMEM-2503，来源于印度Gour Banga大学动物学系微生物与实验医学实验室）进行抗菌活性测试。通过肉汤稀释法测定MIC和MBC。采用结晶紫染色法进行72小时生物膜抑制实验。所有实验重复三次，并进行相关性分析、回归分析、单因素方差分析（ANOVA）及事后检验（Tukey’s HSD、Scheffé、Bonferroni、Holm）。

**研究结果**

**3.1 靶蛋白结构真实性**
通过Ramachandran图和Z评分验证了五个靶蛋白结构的质量。例如，分选酶A（1T2P）有92%的残基位于最有利区域，Z评分为-5.99，表明模型质量高。

**3.2 分子对接**
APGN对所有五个靶蛋白的结合能均高于头孢噻肟（CFTX）。其中，APGN与分选酶A（1T2P）的结合能最低（-8.4 kcal/mol），主要相互作用包括与Gly167、Lys175的常规氢键以及多种疏水作用。CFTX与1T2P的结合能仅为-6.3 kcal/mol。

**3.3 分子动力学模拟**
100 ns MD模拟显示，APGN-1T2P复合物在15 ns内达到平衡，平均RMSD（1.1365 ± 0.0549 nm）低于CFTX-1T2P复合物（1.4709 ± 0.3389 nm），RMSF（0.1381 ± 0.0935 nm）也更低，Rg（1.4911 ± 0.0191 nm）更紧凑，表明APGN-1T2P复合物结构更稳定。

**3.4 相互作用能分析**
APGN的线性相互作用能（LIE）ΔG_bind为44.88 kJ/mol，而CFTX为114.19 kJ/mol，表明APGN与1T2P的结合更稳定。

**3.5 MM-PBSA结合自由能计算**
MM-PBSA计算显示，APGN-1T2P复合物的总结合自由能（ΔTOTAL）为-11.82 ± 3.74 kcal/mol，显著优于CFTX-1T2P复合物（-0.08 ± 1.35 kcal/mol），主要归因于更强的范德华力（-17.36 vs -0.97 kcal/mol）和静电相互作用（-9.00 vs -0.84 kcal/mol）。

**3.6 药理学分析**
APGN符合Lipinski五规则（无违反），生物利用度评分0.55，而CFTX仅0.11。ADMET分析显示，APGN具有较低的肠道吸收（0.015%）但良好的Caco-2渗透性，血浆蛋白结合率高（97.25%），且对多种CYP酶有底物/抑制剂作用。毒性预测表明APGN属毒性5类（LD50=2500 mg/kg），而CFTX属6类（LD50=20000 mg/kg），但APGN的人肝毒性（0.072）低于CFTX（0.912）。

**3.7 体外抗菌活性**
APGN单独使用时，ZDI值为7-24 mm，与CFTX或AMKC联合使用后ZDI增至20-25 mm，生长抑制指数（GII）为0.55-1.00，表明协同作用。APGN对三种菌株的MIC分别为100、175、150 μg/ml，MBC分别为125、175、175 μg/ml。单因素方差分析显示APGN对三种菌株的抗菌活性差异显著（F(2,6)=223.00，P=2.34×10^-6）。

**3.8 生物膜抑制**
APGN在150 μg/ml浓度下对金黄色葡萄球菌72小时生物膜的抑制率高达80.77%，且呈浓度依赖性。Pearson相关性分析显示浓度与抑制率呈显著正相关（r=0.9752，P<0.001），回归模型R2=0.9644，单因素方差分析（F(6,14)=410862.22，P=6.86×10^-36）及四种事后检验均证实了浓度依赖性抑制效果。

**讨论与结论**
讨论部分指出，多靶点计算机模拟与体外验证结果一致，支持APGN对金黄色葡萄球菌的抗菌和抗生物膜作用。APGN主要通过靶向分选酶A（1T2P）发挥作用，并与其他蛋白相互作用。药物化学分析显示APGN具有良好的药物相似性和安全性。结论部分（翻译）如下：
本研究通过互补的计算机模拟（*in silico*）和体外（*in vitro*）研究，证明APGN对金黄色葡萄球菌具有有前景的抗菌和抗生物膜活性。分子对接确定分选酶A（1T2P）为五个靶蛋白中最有利的靶点（-8.4 kcal/mol），而MD模拟、IE分析和MM-PBSA计算确认了APGN-1T2P复合物的稳定性和能量有利性（ΔTOTAL = -11.82 ± 3.74 kcal/mol），并在整个100 ns模拟中保持结构稳定性，优于CFTX。APGN表现出浓度依赖性抗菌活性，抑菌圈为7-25±1.0 mm，MIC为100-175±0.0 μg/ml，MBC为125-175±0.0 μg/ml，在150 μg/ml时生物膜抑制率达80.77%。体外结果彼此一致，ZDI、MIC、MBC和生物膜抑制实验结果相互印证。此外，相关性（r=0.9752）、回归（R2=0.9644）、单因素方差分析（F(6,14)=410862.22；P=6.86×10^-36）以及Tukey’s HSD、Scheffé、Bonferroni和Holm事后分析的一致结果证实了实验发现的可重复性。APGN代表了一种有前景的针对多重耐药金黄色葡萄球菌的植物化学先导化合物。然而，在APGN作为处方药使用前，强烈建议进行当前发现的体内（*in vivo*）验证和临床试验。