Slc26a9通过减少内质网应激诱导的凋亡保护胃黏膜免受门静脉高压损伤

《Life Sciences》：Slc26a9 guards gastric mucosa against portal hypertension by reducing ER stress-induced apoptosis

　　

Slc26a9在门静脉高压性胃病（PHG）中通过减少内质网应激诱导的凋亡保护胃黏膜。研究人员发现，在患者和小鼠的PHG胃黏膜中，SLC26A9表达下调。壁细胞特异性Slc26a9缺失通过凋亡、内质网应激和线粒体损伤加重胃黏膜损伤。恢复Slc26a9表达可减少内质网应激和凋亡，并改善黏膜损伤。Slc26a9通过与含缬酪肽蛋白（VCP）结合，阻断内质网应激驱动的线粒体凋亡通路，从而在PHG中发挥保护作用。

论文解读：Slc26a9通过抑制内质网应激介导的线粒体凋亡保护门静脉高压性胃病胃黏膜屏障

一、研究背景与科学问题

门静脉高压性胃病（portal hypertensive gastropathy, PHG）是肝硬化或非肝硬化门静脉高压的常见并发症，常在内镜检查中偶然发现，可导致急性或大量出血，且治疗效果不佳。正常胃黏膜上皮通过分泌保护因子、形成屏障以及祖细胞增殖维持持续更新，壁细胞和酸性环境在调节黏膜稳态中发挥关键作用。既往研究表明，上皮凋亡增加会损害黏膜防御功能，促进PHG的发生发展。在PHG患者和动物模型中均观察到壁细胞数量减少和功能障碍，这与更严重的上皮凋亡相关。因此，胃上皮细胞和壁细胞的完整性与存活对于维持PHG中的黏膜防御机制至关重要。

Slc26a9是一种氯离子通道和氯-碳酸氢根转运体，主要表达于胃黏膜上皮，调节酸分泌和离子转运。Slc26a9在壁细胞中高表达，并与H⁺-K⁺-ATPase共定位。Slc26a9缺失导致壁细胞丢失、泌酸腺萎缩和囊性腺体扩张，表明其在维持壁细胞功能和胃黏膜结构中发挥重要作用。研究人员先前已证明Slc26a9缺失引起弥漫性黏膜损伤并促进恶性转化，凸显其在胃黏膜保护中的关键作用。

内质网（endoplasmic reticulum, ER）应激在细胞功能障碍和黏膜屏障损伤中发挥重要作用。感染、缺血和缺氧等应激源导致错误折叠蛋白积累，激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）以恢复稳态。然而，过度或持续的内质网应激使UPR从促生存转向促凋亡反应。线粒体依赖性凋亡是内质网应激诱导细胞死亡的关键途径，受Bcl-2家族蛋白调控。在PHG中，胃黏膜上皮细胞的内质网应激增加促进线粒体依赖性凋亡，导致上皮损伤。然而，Slc26a9在PHG中对内质网应激诱导凋亡的作用及其分子机制尚未被研究。

二、研究内容与主要发现

本研究旨在检测Slc26a9对内质网应激诱导凋亡的影响，并探讨其在PHG中保护黏膜防御屏障的分子机制。研究人员首先分析了来自遵义医科大学附属医院的PHG患者（n=17）、无PHG的门静脉高压患者（n=17）和健康对照（n=17）的胃黏膜组织，发现PHG患者胃黏膜中SLC26A9的mRNA和蛋白水平均显著降低，且这种下调与PHG特异性相关，而非单纯门静脉高压所致。在C57BL/6J小鼠中通过部分门静脉结扎（partial portal vein ligation, PVL）成功建立PHG模型，同样观察到Slc26a9表达下调。

为明确Slc26a9在PHG中的功能，研究人员利用壁细胞特异性Slc26a9基因敲除小鼠（Slc26a9^fl/fl/Atp4b-Cre）构建PHG模型。结果显示，与对照小鼠相比，壁细胞特异性Slc26a9缺失显著加重了PHG相关的胃黏膜损伤、上皮凋亡、线粒体依赖性凋亡和内质网应激。TUNEL染色和细胞角蛋白（cytokeratin, CK）双标证实凋亡细胞为黏膜上皮细胞，且凋亡程度与Slc26a9表达呈负相关。Western blot分析显示，线粒体凋亡通路标志物（Bax、Bak、Cyt-C、caspase9、cleaved caspase-3、AIF、Endo G）以及内质网应激标志物（GRP78、caspase-12、p-eIF2α、XBP1、PUMA）在Slc26a9缺失的PHG小鼠中显著上调。

为进一步验证Slc26a9的保护作用，研究人员通过腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus, rAAV）介导的Slc26a9过表达策略恢复PVL小鼠胃黏膜中Slc26a9的表达。结果显示，恢复Slc26a9表达有效逆转了Slc26a9缺失导致的内质网应激增强、线粒体凋亡、上皮凋亡和胃黏膜损伤。在体外实验中，使用衣霉素（tunicamycin）诱导GES-1细胞内质网应激，Slc26a9敲低促进细胞凋亡，而Slc26a9过表达则抑制凋亡，与体内结果一致。

机制研究方面，研究人员发现含缬酪肽蛋白（valosin-containing protein, VCP/p97）在PVL诱导的内质网应激中上调，而Slc26a9缺失则抑制这种上调。免疫荧光和免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, co-IP）实验证实Slc26a9与VCP在细胞质中共定位并相互结合，蛋白-蛋白对接实验也预测了特异性结合位点。这些结果表明Slc26a9可能通过与VCP相互作用来抑制内质网应激。

三、主要技术方法

本研究采用以下关键技术方法：（1）临床样本分析：收集遵义医科大学附属医院内镜获取的新鲜胃黏膜组织，包括PHG患者17例、无PHG的门静脉高压患者17例和健康对照17例，所有患者均排除幽门螺杆菌感染及其他可能影响胃黏膜损伤的混杂因素。（2）动物模型构建：通过部分门静脉结扎（PVL）在C57BL/6J、Slc26a9^fl/fl和Slc26a9^fl/fl/Atp4b-Cre小鼠中建立PHG模型，并设置假手术（sham-operated, SO）对照组。（3）基因操作：采用壁细胞特异性Cre-loxP系统实现Slc26a9条件性敲除；采用重组腺相关病毒（rAAV）载体通过灌胃方式实现胃黏膜Slc26a9过表达修复。（4）分子与细胞生物学技术：免疫组织化学（IHC）、Western blot、qRT-PCR、TUNEL凋亡检测、免疫荧光共定位、免疫共沉淀（co-IP）以及蛋白-蛋白对接分析。（5）体外细胞实验：使用GES-1细胞系（人胃黏膜上皮细胞）进行Slc26a9敲低和过表达，并用衣霉素诱导内质网应激。

四、研究结果详细解析

3.1 Slc26a9在PHG患者和PHG小鼠模型中表达显著下调

通过病理组织学分析，PHG患者胃黏膜呈现水肿、腺体结构紊乱和炎性细胞浸润。IHC和qRT-PCR证实，PHG组织中SLC26a9蛋白和mRNA水平显著低于无PHG的门静脉高压患者和健康对照，表明SLC26a9下调与PHG特异性相关。在C57BL/6J小鼠PVL模型中，成功建立门静脉高压（脾肿大、门静脉压力升高），并观察到胃黏膜损伤和Slc26a9表达下调。

3.2 壁细胞特异性Slc26a9基因缺失加重PHG胃黏膜损伤

在Slc26a9^fl/fl/Atp4b-Cre小鼠中，PVL手术成功建立PHG模型（脾肿大、门静脉压力升高）。组织学评估显示，Slc26a9缺失的PHG小鼠呈现更严重的结构破坏、上皮细胞丢失、水肿、血管扩张和炎性浸润，表明Slc26a9缺失加重了PHG相关的胃黏膜损伤。

3.3 壁细胞特异性Slc26a9基因缺失加重PHG胃黏膜上皮凋亡

TUNEL染色显示Slc26a9缺失的PHG小鼠凋亡细胞显著增多，TUNEL与CK双标证实凋亡细胞为黏膜上皮细胞。TUNEL与Slc26a9双标显示凋亡与Slc26a9表达负相关。Western blot分析表明线粒体凋亡通路标志物（Bax、Bak、Cyt-C、caspase9、cleaved caspase-3、AIF、Endo G）在Slc26a9缺失的PHG小鼠中显著上调。

3.4 门静脉高压联合壁细胞特异性Slc26a9缺失通过激活内质网应激诱导线粒体依赖性凋亡

免疫荧光和Western blot检测显示，内质网应激标志物（GRP78、caspase-12、p-eIF2α、XBP1）和促凋亡蛋白PUMA在Slc26a9缺失的PHG小鼠中表达最高。PUMA是内质网应激下游的BH3-only蛋白，连接内质网应激与线粒体凋亡，证实了该通路的激活。

3.5 腺病毒过表达Slc26a9逆转Slc26a9缺失引起的胃黏膜损伤

通过rAAV-Slc26a9-3xFlag灌胃恢复Slc26a9表达后，组织学检查显示胃黏膜损伤明显改善，结构破坏、上皮丢失、水肿、血管扩张和炎性浸润均被逆转。

3.6 恢复Slc26a9表达通过抑制内质网应激介导的线粒体凋亡减轻胃上皮凋亡

TUNEL和Slc26a9双标显示恢复Slc26a9后上皮凋亡显著减少。GRP78荧光染色和Western blot显示线粒体凋亡标志物和内质网应激标志物均下调，验证了Slc26a9缺失通过激活内质网应激-线粒体凋亡-上皮凋亡通路加重损伤。

3.7 Slc26a9下调通过激活内质网应激-线粒体凋亡通路诱导GES-1细胞凋亡

体外实验使用衣霉素处理GES-1细胞模拟PHG内质网应激，Slc26a9敲低促进凋亡并上调线粒体凋亡和内质网应激标志物，Slc26a9过表达则抑制该过程。

3.8 Slc26a9可能通过与VCP相互作用抑制内质网应激

PVL诱导的内质网应激导致VCP上调，而Slc26a9缺失抑制VCP上调。恢复Slc26a9后VCP表达恢复。免疫荧光、co-IP和蛋白-蛋白对接证实Slc26a9与VCP直接相互作用，提示Slc26a9可能通过结合VCP来抑制内质网应激。

五、讨论与结论

本研究表明，Slc26a9在PHG中通过抑制内质网应激介导的线粒体依赖性凋亡来保护胃黏膜防御屏障。Slc26a9缺失不是黏膜损伤的起始事件，而是增加了上皮对门静脉高压应激的易感性。Slc26a9与VCP的直接相互作用可能是其调控内质网应激的关键机制，但具体调控VCP功能（如ATPase活性、底物招募或ERAD效率）的机制仍需进一步研究。研究也存在局限性，如AAV转导效率未定量、缺乏人源类器官验证等。结论指出，Slc26a9通过减弱内质网应激介导的线粒体依赖性凋亡信号保护胃黏膜防御屏障，为PHG的发病机制提供了新见解，并提示Slc26a9是PHG预防和治疗的潜在靶点。