《Microorganisms》：Identification of B-Cell Linear Epitopes on pE146L Protein of African Swine Fever Virus Using Monoclonal Antibodies
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非洲猪瘟病毒（ASFV）是一种高致病性DNA病毒，持续在全球流行，对养猪业构成严重威胁。然而，ASFV的抗原复杂性给疫苗和诊断试剂的开发带来了巨大挑战。pE146L蛋白作为内包膜的结构组分，是ASFV有效复制所必需的。在本研究中，pE146L蛋白在大肠杆菌Ro
非洲猪瘟病毒（ASFV）是一种高致病性DNA病毒，持续在全球流行，对养猪业构成严重威胁。然而，ASFV的抗原复杂性给疫苗和诊断试剂的开发带来了巨大挑战。pE146L蛋白作为内包膜的结构组分，是ASFV有效复制所必需的。在本研究中，pE146L蛋白在大肠杆菌Rosetta（DE3）细胞中表达，并通过用纯化的pE146L免疫BALB/c小鼠，制备了五株单克隆抗体（mAbs）。利用一组截短重叠片段进行精细表位作图，鉴定出五个B细胞线性表位：aa37–45、aa65–80、aa86–94、aa86–101和aa115–124，分别被mAbs 8F3、1B8、5C10、10F4和4B7识别。此外，基于这些序列设计了合成肽SP1–SP5，其中SP5被制备为覆盖aa110–124的延伸肽段，以增强抗体结合或肽段呈递。这些合成肽不仅与各自的mAbs反应，还与ASFV阳性猪血清反应，其中SP3表现出最强的免疫反应性。序列比对显示，所有五个表位在ASFV基因型I、II以及新出现的I/II重组株中高度保守。总之，这些发现鉴定了pE146L的新型抗原表位，为未来ASFV血清学诊断试剂的开发提供了初步候选。
论文解读文章
研究背景与问题：非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的高度传染性出血性疾病，对全球养猪业和生物多样性构成严重威胁。ASFV是一种大型双链DNA病毒，基因组约170–190 kb，编码超过150种病毒蛋白，参与病毒入侵、免疫逃逸和子代病毒生产。由于ASFV的抗原复杂性，安全有效的疫苗和诊断工具的开发面临巨大障碍。尽管2022年越南批准了两种商品化减毒活疫苗（AVAC ASF LIVE?和NAVET-ASFVAC?），但它们对多种基因型，尤其是新出现的基因型I/II重组株的交叉保护效力不足，且存在毒力恢复等生物安全问题。基于CD2v、p72、p30和p54抗原的亚单位疫苗虽具有中和活性和安全性，但在攻毒实验中仍未能提供足够保护。因此，深入了解ASFV蛋白的抗原特性，特别是识别新的抗原表位，对于开发亚单位疫苗和血清学诊断方法至关重要。pE146L蛋白是ASFV内包膜的结构蛋白，在病毒复制中起关键作用。此前Zhang等利用哺乳动物细胞表达的pE146L获得了三株单克隆抗体并鉴定了表位，但仅依赖单一抗原位点可能因个体免疫差异或田间株序列变异导致假阴性。因此，有必要对pE146L进行更全面的抗原表位研究。
研究人员开展了什么研究：本研究利用原核表达系统在大肠杆菌Rosetta（DE3）中表达并纯化了pE146L蛋白，通过免疫BALB/c小鼠制备了五株新型单克隆抗体（mAbs：4B7、5C10、10F4、1B8和8F3）。采用逐步截短重叠片段策略，通过间接ELISA、Dot-blot和免疫荧光实验（IFA）精细定位了这些mAbs识别的线性B细胞表位。基于定位结果合成了相应肽段（SP1–SP5），并评估了它们与mAbs及ASFV感染猪血清的反应性。最后通过序列比对和结构预测分析了表位的保守性和空间分布。论文发表在《Microorganisms》。
主要关键的技术方法：研究人员采用原核表达系统（大肠杆菌Rosetta (DE3)）表达His标签的pE146L蛋白，经Ni亲和层析纯化。通过杂交瘤融合和细胞亚克隆筛选，获得五株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。利用逐步截短策略，先分为三个GST融合片段（P1–P3），再细分为EGFP融合的短肽，转染293T细胞后通过IFA进行精细表位定位。同时，使用间接ELISA和Dot-blot验证合成肽与mAbs及ASFV阳性猪血清的反应性。样本来源：ASFV标准阳性猪血清购自中国兽医药品监察所；另外5份2018年后采集的ASFV阳性猪血清和1份阴性猪血清来自研究人员实验室。
研究结果：
3.1. 重组pE146L的表达与免疫原性：通过SDS-PAGE和Western blot确认纯化的pE146L蛋白（约36 kDa）与抗His抗体和ASFV标准阳性猪血清特异性反应。免疫BALB/c小鼠后，血清抗体滴度达1:12800，表明重组蛋白具有良好的免疫原性。
3.2. 抗pE146L单克隆抗体的筛选与鉴定：经三轮筛选和亚克隆，获得五株杂交瘤（10F4、5C10、1B8、8F3和4B7）。抗体滴度范围为1:6400–1:25600，亚型鉴定显示1B8、8F3、4B7为IgG2b/κ，10F4和5C10为IgG2a/κ。IFA证实五株mAbs均特异性识别pE146L。
3.3. pE146L蛋白的初步表位定位：将全长pE146L分为三个GST融合片段P1–P3（对应N端、中央和C端区域）。间接ELISA和Dot-blot显示，mAbs 5C10、1B8和10F4识别P2，8F3识别P1，4B7识别P3，表明表位分布于蛋白的不同区域。
3.4. 五个mAbs精细表位的鉴定：将P1、P2、P3进一步细分为EGFP融合的短肽。IFA结果显示，mAb 8F3识别P1-1和P1-2（aa37–45），1B8识别P2-2（aa65–80），10F4识别P2-5（aa86–101），5C10识别P2-4和P2-5（aa86–94），4B7识别P3-1和P3-2（aa115–124）。由此确定五个线性表位分别为aa37–45（SP1）、aa65–80（SP2）、aa86–94（SP3）、aa86–101（SP4）和aa115–124（SP5）。
3.5. 合成肽与mAbs及ASFV感染阳性猪血清的反应性：根据精细定位结果合成SP1–SP5，其中SP5延伸为aa110–124。ELISA和Dot-blot显示，SP1–SP5分别被相应的mAbs特异性识别；SP4因包含SP3序列，故同时被mAbs 5C10和10F4识别。ASFV阳性猪血清（#1–#5）与全长pE146L及所有合成肽呈阳性反应，其中SP3的反应性最强。阴性猪血清（#6）无反应。
3.6. 鉴定表位的生物信息学分析：对22个ASFV株（包括基因型I、II、IX、X、XV及I/II重组株）的pE146L序列进行比对，发现SP1、SP3、SP4在所有基因型中高度保守，SP2和SP5主要在基因型I和II中保守。AlphaFold 3预测的结构显示，所有表位均位于pE146L蛋白外表面，但SP4部分区域可能埋藏，这解释了mAb 10F4在初步定位中结合较弱的可能原因。
总结讨论与结论：讨论部分指出，本研究获得的五个新表位中，SP1与Zhang等报道的免疫优势表位重叠，验证了该区域的抗原重要性。另外四个新表位（SP2–SP5）在合成肽水平上与ASFV阳性猪血清反应，证实pE146L含有多个抗原位点。序列保守性分析支持这些表位作为广谱抗原靶标的潜力，但需在更大样本量中验证其诊断性能。研究结论：研究人员成功制备了五株pE146L特异性单克隆抗体，并精细定位了其线性表位（aa37–45、65–80、86–94、86–101和115–124）。源自这些表位的合成肽（SP1–SP4及延伸肽SP5 aa110–124）与ASFV感染阳性猪血清具有强反应性，表明这些表位在ASFV感染过程中具有抗原性并被识别。这些发现鉴定出新型表位候选物，可作为未来多表位检测方法的潜在组分，但需进一步用更大、特征明确的血清样本进行验证。
