《Acta Biomaterialia》：Convergent Design Principles for Functional Sensory Innervation in Bioprinted and Engineered Skin Constructs
功能性感觉神经支配仍然是皮肤组织工程和生物制造领域最具挑战性的未解问题之一。尽管在重建表皮和真皮结构方面已取得进展，但大多数工程化皮肤替代物仍无法重现感觉、神经免疫通讯和组织稳态所必需的复杂神经皮肤相互作用。本综述全面分析了当前工程化神经支配皮肤构建物的策略，重点关注生物材料、感觉神经生物学、生物制造技术、多细胞共培养系统和功能验证方法的趋同整合。此外，还重点探讨了调控感觉整合的生物学决定因素，包括神经元亚型特化、施万细胞介导的调控、内源性神经营养信号、神经血管协调和神经免疫串话。新兴的人源化平台，包括诱导多能干细胞来源的感觉神经元、器官芯片系统和生物电子接口，在转化相关性和疾病建模的背景下进行了讨论。除常规电生理评估外，本综述还审视了神经化学和模态特异性功能验证方法，包括神经肽释放测定和受体靶向刺激范式。研究提出了一个最小功能验证框架（Minimum Functional Validation Framework, MFVF），用于对工程化感觉皮肤系统的结构性、功能性和转化性基准进行分类。本综述强调，需要从简单的神经突整合转向开发能够重现高阶感觉生理学的整合性神经皮肤平台，以应用于再生医学、药物筛选、疾病建模和神经假体工程。
Statement of Significance：感觉功能的重建仍然是工程化和生物打印皮肤中的一个挑战，尽管在组织结构和血管化方面已取得进展。本综述评估了当前神经整合策略，并强调了结构性神经支配与功能性感觉表现之间的持续差距。研究人员引入了一个基于决定因素的框架，涵盖细胞活力、空间组织、分子信号和功能激活，以及一个区分结构性神经存在与真正感觉能力的最小功能验证框架（MFVF）。通过将生物学、生物材料、结构、生化和电活性设计策略与标准化验证标准相结合，本综述为开发具有感觉能力的皮肤构建物提供了路线图。该框架支持改进实验设计、功能评估和向临床有意义的感觉恢复的转化进展。
**1. 引言**
**1.1. 具有感觉能力的皮肤重建的临床需求**
皮肤是人体最大的器官，作为生物界面发挥保护、体温调节、体液平衡和感觉交互等功能。皮肤同时也是一个特化的神经免疫皮肤器官，包含感觉传入神经、自主神经纤维、免疫细胞、血管结构和上皮组分的密集网络，调控组织稳态和环境感知。严重烧伤、创伤性损伤、糖尿病溃疡和慢性不愈合伤口可破坏这一复杂结构，导致屏障完整性受损以及感觉功能、疼痛感知、温度辨别和保护性机械感觉的缺陷。目前的临床皮肤替代策略，包括分层厚度自体移植物、同种异体移植物、脱细胞真皮基质和市售组织工程替代物，主要侧重于恢复结构覆盖和预防感染或液体丢失。这些方法改善了伤口闭合和生存结果，但很少能恢复功能性感觉能力。即使在移植成功整合后，患者仍会经历长期感觉异常，包括感觉减退、感觉迟钝、神经病理性疼痛、温度感觉受损和触觉敏锐度降低。在严重烧伤损伤中，不完全的感觉恢复可降低生活质量并因感觉丧失而增加未来受伤的风险。
三维（3D）生物打印、生物材料工程、干细胞生物学和生物制造技术的进步推动了结构性工程化皮肤构建物的发展。现代生物打印系统可以组织多种细胞群体，制造多层真皮-表皮结构，生成血管化组织隔室，并精确调节支架力学性能。然而，功能性感觉神经支配的恢复仍然是工程化皮肤重建中发展较少的方面之一。大多数构建物显示神经整合或神经突延伸的证据，但很少有研究提供刺激响应性神经活动、有组织的感觉网络形成或植入后长期功能整合的证据。最近结合人源皮肤细胞和感觉神经元的3D神经支配皮肤模型表明，神经元整合到工程化皮肤构建物中越来越可实现；然而，目前的证据主要侧重于建立可重复的共培养平台和展示初步的感觉响应行为，而非全面恢复天然感觉功能。天然感觉依赖于特化的神经元亚型、有组织的神经上皮相互作用、模态特异性机械转导系统以及协调的神经血管和神经免疫信号通路。在工程化组织系统中重现这些关系仍然是一个转化挑战。
**1.2. 天然皮肤感觉结构和机械转导**
感觉源于外周感觉神经元群体和分布于皮肤各处的特化机械感觉终末器官的协调活动。这些系统通过不同的受体群体和转导机制实现对机械力、振动、牵拉、温度、瘙痒和伤害性刺激的检测。天然皮肤神经支配的功能复杂性对试图重现生理学有意义感觉活动的组织工程方法构成了挑战。
低阈值机械感受器通过位于真皮和表皮的特化终末器官结构介导触觉感觉。位于基底层表皮的默克尔细胞-神经突复合体负责涉及精细触觉辨别和压力感知的慢适应I型反应。位于真皮乳头的迈斯纳小体介导与轻触相关的快适应反应。位于真皮和皮下组织更深处的帕西尼小体检测高频振动和压力变化，而鲁菲尼末梢则参与皮肤牵拉感知和本体感觉反馈。相比之下，分布于表皮和真皮层的游离神经末梢通过多觉型感觉通路介导伤害感受、温度感觉和瘙痒感受。这些感觉活动由异质性神经元亚型调控，这些亚型由不同的转录程序、受体表达谱、离子通道组成和电生理行为所定义。机械转导依赖于特化的离子通道和受体系统，包括PIEZO2、TRPV1、TRPA1、TRPM8、神经元酸敏感离子通道（ASIC）和电压门控钠通道如Nav1.8。因此，功能性感觉信号传导需要的不仅仅是支架内的神经突延伸；它依赖于亚型特异性神经元身份的保持以及神经元与靶组织隔室之间的正确偶联。
**1.3. 超越神经元的生物学复杂性：施万细胞、神经免疫串话与皮肤神经支配**
施万细胞被视为负责外周神经再生过程中轴突髓鞘形成和营养维持的支持性胶质细胞。在工程化皮肤系统中，施万细胞被用于增强神经突延伸、改善神经元存活和促进轴突导向。神经免疫和神经血管相互作用在调控感觉稳态中发挥重要作用。感觉神经元通过细胞因子、神经肽、生长因子和炎症介质与角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肥大细胞、巨噬细胞和其他免疫群体进行双向相互作用。同时，细胞外囊泡通过介导角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞和炎症细胞之间的信号传导，参与伤口修复过程中的皮肤细胞通讯，但它们在感觉神经元-皮肤细胞通讯中的直接作用仍不太明确。角质形成细胞释放神经生长因子（NGF）、ATP、细胞因子和炎症介质，能够影响伤害性信号传导和表皮轴突导向。成纤维细胞通过分泌NGF、血管内皮生长因子（VEGF）和细胞外基质重塑因子提供神经营养支持，而内皮细胞通过释放脑源性神经营养因子（BDNF）和血管生成介质参与神经血管信号传导。
**1.4. 工程化感觉皮肤构建物的当前局限性**
工程化皮肤中神经整合的策略可大致分为基于细胞的、基于生物材料的和基于生物制造的方法。实例包括用于烧伤治疗的组织工程皮肤和神经再生方法、用于疾病建模和药物发现的皮肤-神经共培养系统、富含层粘连蛋白的组织工程皮肤以增强移植后感觉感知恢复、使用纤维蛋白基底生物墨水打印的人iPSC来源神经组织、iPSC来源的瘙痒感觉神经元样神经支配皮肤模型、用于神经组织工程的导电纳米纤维支架、用于神经营养因子递送的NGF和BDNF功能化支架，以及用于空间轴突组织的多孔微通道神经导向结构。这些策略共同旨在支持神经突延伸、营养信号传导、空间导向和神经活动，尽管功能性感觉验证的水平在不同研究中有所差异。该领域的一个主要限制是依赖结构性神经支配指标作为功能恢复的标志。终点指标包括神经突密度、神经元标志物表达、轴突穿透深度和定性免疫荧光分析。当前的验证方法提供了关于支架相容性和轴突整合的信息，但对网络组织、感觉特化或长期组织性能的洞察有限。
**1.5. 综述范围与概念框架**
本综述通过趋同神经-生物制造设计的视角，审视了在工程化和生物打印皮肤构建物中实现功能性感觉神经支配的当前策略。综述并非将神经整合作为孤立结果进行评估，而是聚焦于感觉整合的四个相互依赖的决定因素之间的相互作用：（i）细胞活力和感觉身份，（ii）空间和解剖组织，（iii）通过营养和免疫调节信号传导的分子指令，以及（iv）电生理和神经化学功能性。本综述进一步引入了一个最小功能验证框架（MFVF），旨在区分结构性神经支配证据与逐渐更高水平的功能性感觉验证。该框架根据工程化系统实现结构性神经整合、刺激响应性神经激活和功能性感觉恢复的能力对其进行组织。通过整合外周神经生物学、生物材料工程、神经免疫信号传导和生物制造技术的见解，本综述为开发具有感觉能力的工程化皮肤构建物提供了更全面的概念基础。
**2. 方法与范围综述设计**
**2.1. 综述框架与研究设计**
本综述按照系统综述和荟萃分析的首选报告项目扩展-范围综述（PRISMA-ScR）框架中概述的方法学原则进行。选择范围综述方法是因为工程化皮肤构建物中的感觉神经支配领域是跨学科的且快速发展的，涵盖生物材料科学、外周神经生物学、组织工程、再生医学、干细胞生物学和生物制造技术。研究设计、神经细胞来源、生物材料系统和功能验证策略的广泛多样性目前限制了传统荟萃分析综合的可行性。范围综述方法最适合系统地绘制现有文献、识别趋同设计策略和评估功能性感觉重建的新兴趋势。
**2.2. 文献检索策略**
使用PubMed、Scopus、Web of Science和Google Scholar数据库进行了全面文献检索，以识别1980年至2026年间发表的相关研究。此外，通过对相关综述文章和原始研究的参考文献筛选进行了额外的手动检索。为应对该领域的跨学科性质，检索策略纳入了涵盖皮肤组织工程、外周神经生物学、感觉生理学、干细胞分化、生物制造和神经免疫信号传导的关键词。初步检索词包括"engineered skin"、"bioprinted skin"、"skin substitute"、"sensory innervation"、"peripheral nerve"、"dorsal root ganglion"、"Schwann cell"、"neurotrophic factor"和"neuronal integration"等组合。在初步审阅者对文献覆盖范围进行重新评估后，检索策略大幅扩展以纳入额外的神经生物学术语，包括"GDNF"、"mechanotransduction"、"TRPV1"、"TRPA1"、"MrgprA3"、"neuropeptide release"、"cutaneous sensory neuron"、"skin-on-chip"、"neuroimmune"、"neurovascular"、"mechanoreceptor"、"sensory Schwann cell"、"PIEZO2"和"extracellular vesicle"。检索策略结合了医学主题词（MeSH）和自由文本关键词，使用布尔运算符。
**2.3. 纳入标准**
纳入标准包括研究工程化、组织工程化、生物制造或生物打印皮肤系统，其中包含旨在促进感觉神经支配、神经整合或功能性神经皮肤信号传导的神经元或神经支持组分。合格研究包括涉及神经元整合到皮肤构建物、神经营养调节、支架引导神经组织、神经生理学评估或植入后感觉再生的体外、离体和体内实验数据。涉及DRG神经元、iPSC来源感觉神经元、神经嵴来源群体、施万细胞、神经干细胞或多细胞神经皮肤共培养系统的研究均被纳入。评估电生理活动、钙成像、神经肽释放、机械转导、神经免疫信号传导或功能性感觉恢复的文章也被纳入。仅关注不含皮肤组织组分的外周神经导管的研究被排除，除非它们与工程化皮肤神经支配具有直接转化相关性。同样，不含神经或神经生理学组分的伤口愈合研究被排除。编辑评论、无完整实验细节的会议摘要、纯计算建模研究和非英文出版物也被排除。
**2.4. 研究筛选与选择**
所有检索记录均由单一审阅者根据预定义的纳入标准独立进行标题和摘要筛选。对相关研究的全文进行了详细审阅。在全文评估过程中，分析文章是否包含神经元整合策略、生物材料设计方法、多细胞相互作用、功能评估方法和转化性感觉结果。特别关注展示直接功能性神经活动证据的研究，包括电生理记录、钙信号传导、激动剂响应性刺激、神经肽释放或体内感觉恢复。仅报告结构性神经突延伸而无功能表征证据的研究被保留，但在综合过程中单独分类，以实现结构性和功能性神经整合水平之间的比较。
**2.5. 数据提取与主题综合**
对所有纳入研究进行了系统化数据提取，以捕获与感觉皮肤重建相关的关键生物学、工程学和功能参数。提取的变量包括神经细胞来源、物种来源、生物材料组成、支架结构、制造策略、共培养配置、神经营养补充、电生理评估方法、神经化学测定、植入结果和感觉恢复终点。为便于比较综合，研究根据影响功能性感觉整合的四个趋同决定因素进行组织：细胞活力和感觉身份、空间组织和结构引导、分子和营养指令、以及电生理或神经化学功能性。除结构分类外，研究还根据所实现的功能验证程度进行进一步评估。
**2.6. 综述方法的局限性**
在解读本综述发现时需要考虑若干局限性。首先，该领域在实验设计、生物材料组成、神经细胞来源和功能评估方法方面仍然高度异质。研究之间的直接定量比较因此受限，特别是电生理结果和体内感觉恢复指标。其次，关于感觉神经支配和神经功能性的术语在文献中仍不一致。许多研究仅基于神经突存在或神经元标志物表达来报告"innervation"，而未评估刺激依赖性生理活动。第三，相关领域的快速扩展，包括器官芯片技术、感觉神经生物学、干细胞工程和神经免疫研究，引入了新研究可能尚未被传统组织工程检索框架全面索引的可能性。尽管存在这些局限性，本综述仍是目前关于工程化皮肤系统中功能性感觉神经支配的最全面跨学科综合之一。
**3. 功能性感觉皮肤工程的生物学决定因素**
**3.1. 皮肤感觉重建的生物学复杂性**
功能性神经支配皮肤的成功工程化需要重建人体中最具生物学复杂性的外周感觉环境之一。天然皮肤神经支配并非均匀的神经元网络，而是多种感觉神经元亚型、特化胶质群体、血管界面、免疫调节因子、上皮信号系统和细胞外基质结构的集合，共同控制感觉、组织稳态、伤口修复和炎症信号传导。具有有意义感觉功能的工程化皮肤构建物的发展超越了简单的神经元整合。外周感觉神经元具有显著的分子和功能多样性。不同的神经元亚群通过特化受体系统和离子通道表达谱负责机械感觉、伤害感受、温度感觉和瘙痒感受。触觉敏感的感觉亚型主要由PIEZO2依赖性力转导定义，而伤害性群体则通过能够检测热、化学刺激物、酸性和疼痛刺激的通道来区分。表达MrgprA3的DRG神经元代表与瘙痒信号传导相关的瘙痒感受亚群，且Mrgpr家族受体激活与氯喹诱导的瘙痒有关。这些亚型特异性特征强烈影响神经元如何与生物材料相互作用、如何响应生化线索以及如何在工程化组织系统内整合。
**3.2. 背根神经节神经元：当前感觉建模的金标准**
DRG神经元因其包含初级感觉神经元群体，包括参与PIEZO2依赖性触觉感受的机械感受神经元、参与疼痛信号传导的伤害性神经元和与瘙痒信号传导相关的瘙痒感受亚群，而仍然是研究外周感觉神经支配的广泛使用的实验模型。原代DRG神经元培养提供了生理学相关的感觉神经元模型，因为分离的感觉神经元保持了体内感觉神经末梢的特征，保留了多样的响应特性，并能在适当培养条件下发展出神经突和轴突树状化。鼠胚胎和新生DRG神经元在临床前组织工程研究中特别常见，因为解离和外植体培养方案已建立完善，细胞相对易获取，且神经突生长可在体外快速评估。然而，必须谨慎讨论基于DRG的模型，因为其生物学相关性取决于所用物种、发育阶段、培养形式、保留的支持细胞、生物材料环境和所测功能终点。Gingras等人开发了一种三维组织工程外周神经再生模型，其中小鼠DRG神经元被接种到含人成纤维细胞和/或内皮细胞的胶原海绵上。使用150 kDa神经丝蛋白的免疫染色评估神经突生长，作者报告了重建组织内旺盛的轴突延伸。Blais等人开发了一种神经支配的组织工程伤口愈合模型，以确定感觉神经元是否影响表皮修复。该模型由穿孔表皮隔室组成，用人角质形成细胞重建，置于神经支配或非神经支配的真皮隔室上方。感觉神经元在构建物内分泌P物质并加速伤口闭合，与非神经支配对照相比效果显著。施万细胞富集促进了三维组织内感觉神经突迁移的约两倍增加，支持了施万细胞沿神经突的共定位，并在体外促进了髓鞘形成。移植后，施万细胞富集的重建皮肤在60天和90天时分别显示1.8倍和1.7倍的神经纤维迁移增加，并改善了Aβ纤维感觉功能。
**3.3. 诱导多能干细胞来源的感觉神经元与人源化神经皮肤模型**
iPSC来源的感觉神经元已成为开发人源化神经皮肤模型的重要策略，因为它们提供了可再生的细胞来源，可从患者特异性体细胞生成，并可使用明确的分化方案定向分化为感觉神经元谱系。与原代人DRG神经元相比，iPSC来源系统提供了更具可扩展性的平台，用于疾病建模、药物测试和工程化组织制造。然而，其适用性取决于神经元身份、亚型特化和功能成熟度的验证严格程度。早期分化研究表明，使用小分子图案化方法可将人多能干细胞转化为伤害感受器样感觉神经元。这些方案生成了表达感觉谱系标志物如BRN3A、ISL1、外周蛋白、TRPV1和Nav1.8的神经元，以及符合感觉神经元分化的电生理特性。Müller等人开发了一种含人iPSC来源感觉神经元和施万细胞的神经支配组织工程皮肤模型。在该研究中，感觉神经元从正常皮肤成纤维细胞生成的人iPSC分化而来。成熟后，细胞表达神经元和感觉相关标志物，包括BRN3A、βIII-微管蛋白、TRPV1、神经丝-M、P物质、TrkA和TRPA1。作者还表明，iPSC来源感觉神经元在刺激后释放P物质和CGRP，支持感觉相关的神经肽活性。重要的是，只有当施万细胞被包含时，才观察到这种有组织的神经突延伸，表明胶质支持对于支架内有效神经组织是必需的。Malheiro等人通过将iPSC来源的伤害感受器神经球与人皮肤等效物结合在分隔的胶原/纤维蛋白水凝胶平台中，进一步推进了人源化神经支配皮肤建模。Rousi等人开发了一种完全人源化的神经支配3D皮肤模型，包含真皮、表皮和神经元隔室。在该系统中，原代人成纤维细胞和角质形成细胞与在电纺PEOT/PBT纤维基底平台上培养为单神经球的iPSC来源感觉神经元结合。Guo等人通过工程化一种由瘙痒感觉神经元样细胞神经支配的人皮肤模型，证明了亚型特异性iPSC来源感觉神经元的价值。
**3.4. 施万细胞与胶质对感觉功能的贡献**
施万细胞是外周神经发育、轴突维持、髓鞘形成和修复的调节因子。在工程化感觉组织中，它们通常主要被描述为营养性或髓鞘形成支持细胞；然而，这种解释是不完整的。施万细胞还调节局部修复环境、塑造细胞外基质组织，并通过修复相关的表型变化引导再生轴突。在组织工程皮肤中，Blais等人表明施万细胞富集的构建物改善了移植后的神经再生，与缺乏施万细胞的构建物相比，神经纤维迁移更多且感觉恢复更好。Müller等人还证明，当人iPSC来源感觉神经元被整合到组织工程皮肤模型中时，施万细胞支持是有组织神经突延伸所必需的。这些机制涉及生化和结构调控。施万细胞通过修复相关信号传导、营养支持、髓鞘清除和细胞外基质重塑来支持轴突维持和再生。最近的神经生物学进一步表明，施万细胞可直接参与感觉功能。特化的皮肤施万细胞已被证明参与皮肤内的疼痛启动和感觉信号传导。感觉施万细胞也被证明可调节触觉的感知阈值并选择性影响机械性伤害感受。
**3.5. 感觉重建的替代细胞来源**
除原代感觉神经元和iPSC来源感觉神经元系统外，神经干细胞、神经嵴来源干细胞和间充质基质细胞群体也被研究作为神经组织工程和外周神经再生的替代细胞来源。这些群体尚未像原代DRG神经元或iPSC来源感觉神经元那样广泛地整合到工程化皮肤构建物中，但它们仍然相关，因为它们提供扩增潜力、多谱系分化能力和支持性旁分泌功能，可适用于未来的神经皮肤平台。神经嵴来源群体特别相关，因为神经嵴在发育过程中产生外周神经系统谱系，包括感觉神经元和施万细胞。人间充质基质细胞亚群表达神经调节分子并可促进神经元存活和神经突生成。重要的是，该研究表明MSC的作用是通过旁分泌神经营养支持介导的，而非直接的感觉神经元替代。
**3.6. 神经皮肤串话与内源性营养信号传导**
天然皮肤神经支配受感觉神经元与周围上皮、基质、血管、免疫和胶质隔室之间的持续通讯调控。在工程化感觉皮肤中，这一点很重要，因为多细胞共培养系统可提供动态营养和炎症线索，而补充固定浓度外源生长因子的分离神经元单培养无法完全重现这些线索。角质形成细胞是表皮-神经元通讯的主要贡献者。角质形成细胞分泌物包括生长因子、细胞因子、细胞外基质相关介质和与表皮修复及组织稳态相关的炎症信号。更具体地，角质形成细胞可响应通过ERK1/2和JNK MAPK相关通路的神经肽激活而表达神经生长因子（NGF）和细胞因子。功能研究表明角质形成细胞可调节并直接启动伤害性反应，支持其作为主动感觉调节细胞而非纯粹结构性表皮组分的角色。成纤维细胞主要通过细胞外基质重塑、基质信号传导和机械响应性营养因子产生来促进感觉微环境。人真皮成纤维细胞的拉伸刺激可独立于张力诱导的TGF-β增加NGF产生，表明成纤维细胞可将真皮微环境中的机械变化转化为与感觉神经支配相关的神经营养信号。内皮细胞也可能通过营养和导向相关信号传导促进神经组织。人内皮细胞已被证明可分泌能够引导外周神经轴突生长的神经营养因子。除直接细胞间串话外，细胞外囊泡也可能参与细胞间通讯。皮肤细胞来源的细胞外囊泡通过介导皮肤驻留细胞（包括表皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和炎症细胞）之间的通讯参与皮肤修复。内源性营养信号传导也应与外源性生长因子递送区分开来。基于生长因子的策略使用NGF、BDNF、GDNF等相关分子已被广泛研究用于外周神经再生。推注或支架介导的分离生长因子递送不能完全重现天然皮肤的动力学信号环境。
**3.7. 感觉皮肤工程中的神经免疫与神经血管整合**
皮肤感觉生理学通过神经元、免疫和血管系统之间的相互通讯进行调控。感觉神经元通过神经肽、细胞因子、趋化因子和炎症介质与免疫群体（包括巨噬细胞、肥大细胞、树突状细胞和T细胞）相互作用，影响组织稳态、伤口愈合、炎症和感觉行为。这些相互作用对工程化皮肤很重要，因为感觉信号传导不是孤立的神经元过程；它受周围组织炎症和免疫状态的塑造。P物质和降钙素基因相关肽（CGRP）提供了神经免疫信号传导的特征性实例。激活的感觉传入神经释放的P物质可促进炎症信号传导、肥大细胞激活、血管通透性和白细胞相关反应。CGRP与血管舒张和血管调节密切相关，也可调节外周组织中的炎症和免疫反应。肥大细胞在皮肤中特别相关，因为它们位于感觉神经附近，可响应神经递质和神经肽，将神经元激活与瘙痒、炎症和神经源性炎症反应联系起来。神经血管相互作用也是感觉组织修复的核心。外周神经和血管在发育和再生过程中共享引导机制，血管结构提供神经元存活和维持所需的氧气、营养和营养支持。在皮肤中，感觉神经已被证明可影响动脉分化和血管分支，表明皮肤神经纤维可直接影响血管图案化。
**4. 功能决定因素与验证框架**
**4.1. 超越结构性神经支配：功能验证的必要性**
当前感觉皮肤工程文献中的一个限制是持续依赖结构性神经支配标志物，包括神经突延伸、神经元标志物表达和神经网络形成，作为成功的主要指标。这些评估提供了关于细胞存活和形态组织的重要信息，但它们不一定捕获定义天然感觉系统的电生理活动、神经化学信号传导、机械转导或神经免疫调节。功能性感觉能力需要超越结构表征的验证，通过能够评估刺激响应行为和生理神经活动的测定。这一区别对于涉及疾病建模、神经炎症研究、再生医学和药物筛选的转化应用很重要。例如，研究慢性疼痛、瘙痒、糖尿病神经病变或炎症性皮肤病需要评估伤害性敏化、神经肽释放、表皮-神经元通讯和神经免疫信号传导，而非仅简单的神经元存在。同样，用于重建医学的组织移植物需要恢复保护性感觉和机械感觉反馈，而非仅组织学证据的神经浸润。将验证分为三个水平是有用的：结构相容性、生理活动和感觉相关性。结构相容性包括神经元存活、神经突延伸、轴突穿透和一般神经元标志物如βIII-微管蛋白、PGP9.5、外周蛋白和神经丝的表达。感觉相关标志物如TRPV1、TRPA1、PIEZO2或Nav1.8的表达可提供感觉谱系或亚型身份的额外证据，但标志物表达本身并不能确认功能性受体活性。生理活动包括膜片钳记录、微电极阵列活动、钙成像和刺激诱发的去极化，这些提供了更强的证据表明神经元具有电活动性和响应性。然而，除非刺激反映明确的感觉模态，否则即使这些测定也可能无法完全确认感觉相关性。感觉相关性需要证据表明构建物能响应生物学上有意义的输入，如机械变形、热、冷、瘙痒原、炎症介质或表皮应用受体特异性激动剂。
**4.2. 工程化感觉网络的电生理评估**
电生理记录是评估工程化组织内神经元功能性的基础方法之一。包括膜片钳电生理学、细胞外记录、微电极阵列（MEAs）和基于生物传感器的监测在内的技术可用于评估工程化感觉构建物内的神经元兴奋性、动作电位产生、网络活动和刺激诱发反应。膜片钳电生理学是单细胞功能分析的金标准方法，因为它直接测量离子电流、膜兴奋性、动作电位发放和受体响应性。在工程化感觉组织中，它特别适用于确认iPSC来源感觉神经元中模态相关特性，如TRPV1相关伤害性反应。然而，膜片钳记录技术要求高、具有侵入性、通量相对较低，且难以在致密3D水凝胶构建物内应用。MEAs提供了一种互补方法，能够跨神经元网络进行纵向和空间分布的细胞外电活动记录。与膜片钳电生理学相比，MEAs更适合监测同步放电、网络连接、传导行为、刺激诱发活动和随时间的功能稳定性。MEA系统还可与微流控平台集成以检查活神经元网络中的结构-功能关系。然而，MEAs具有比膜片钳系统更低的单细胞和离子通道分辨率，因此对识别亚型特异性受体机制效果较差。
**4.3. 基于钙的功能激活与网络动力学**
钙成像已成为工程化感觉系统内广泛使用的功能评估工具，因为它允许非侵入性、实时地可视化大片细胞群体中的神经元活动。通过监测与膜去极化、受体激活或细胞间信号传导相关的细胞内钙通量，钙成像可用于评估生物制造神经组织内的刺激响应行为、同步网络活动和功能连接性。与单细胞膜片钳电生理学不同，钙成像允许同时监测更广泛的多细胞区域，使其对含有异质性神经元群体和多细胞神经皮肤相互作用的工程化感觉组织尤为有用。在感觉皮肤工程中，当与明确的感觉刺激配对时，基于钙的方法特别有用。例如，局部辣椒素应用已被用于激活再神经支配的器官型人皮肤模型中的原代感觉神经元，支持在皮肤相关系统中使用基于刺激的测定来评估伤害感受器相关激活。表达伤害感受器相关离子通道如TRPV1、TRPA1、Nav1.8或酸敏感离子通道的神经元可根据所施加的化学或炎症刺激表现出不同的激活谱。机械诱发的钙信号传导也可能与表皮-神经元通讯相关；Shindo等人表明对角质形成细胞的机械刺激可通过细胞外ATP诱导信号传导至感觉神经元。在这些测定中，钙反应应定量报告而非仅描述为阳性或阴性激活。
**4.4. 神经化学信号传导与神经肽释放**
电生理和基于钙的测定提供了关于神经元兴奋性和激活的重要信息，但许多感觉功能也依赖于神经化学信号传导。外周感觉神经元释放神经肽、细胞因子和炎症介质，调节神经免疫通讯、血管通透性、伤口修复和伤害性敏化。神经肽释放测定因此是功能验证的重要组成部分，因为它们评估整合的神经元是否能产生与疼痛、瘙痒、炎症和神经源性组织反应相关的生化输出。P物质和CGRP是与伤害性信号传导和神经源性炎症相关的最常评估的神经肽。在化学、热、机械或炎症刺激激活后，伤害性神经元可将这些介质释放到周围组织环境中，影响血管舒张、免疫细胞募集、肥大细胞激活和表皮信号通路。这些测定提供了电记录无法单独捕获的信息，因为它们测量感觉神经元的下游分泌反应，而非仅膜兴奋性或网络放电。刺激特异性激动剂可用于评估整合的神经元是否显示亚型相关的感觉反应。辣椒素常用于激活TRPV1阳性伤害性神经元，而异硫氰酸烯丙酯用于激活TRPA1相关刺激物敏感通路。氯喹及相关化合物可用于评估MrgprA3相关瘙痒感受反应。在工程化皮肤系统中，当与定量输出（如P物质或CGRP释放、剂量-反应行为、反应时间、重复刺激稳定性和与未刺激对照的比较）配对时，这些激动剂提供的信息最为丰富。
**4.5. 机械转导与模态特异性感觉功能**
感觉皮肤工程的转化目标是恢复生理学上有意义的感觉行为，而非简单地将神经元整合到构建物中。天然皮肤感觉系统包含特化受体结构和模态特异性神经元群体，负责检测触觉、压力、振动、温度、瘙痒和伤害性刺激。皮肤中的机械转导依赖于细胞外基质力学、机械敏感离子通道、上皮信号传导、胶质调节和特化受体相关结构之间的协调相互作用。PIEZO2相关机械感觉通路是触觉机械转导的核心，而TRPV1阳性伤害感受器则有助于热和炎症性疼痛信号传导。默克尔细胞-神经突复合体、迈斯纳小体、鲁菲尼末梢和帕西尼小体各自具有与不同触觉模态相关的独特解剖和生理特征。大多数工程化感觉构建物尚未重现这种程度的特化，而是产生相对泛化的神经元网络。因此，模态特异性测试应与模型的预期生物学功能相匹配。设计用于触觉感知的构建物应使用受控压痕、牵拉、压缩、振动或基底变形测定进行评估。设计用于建模伤害感受或瘙痒的构建物应使用明确的受体或介质基础刺激进行测试，如辣椒素敏感伤害性激活、瘙痒原暴露、炎症介质处理或热和化学刺激。机械感觉响应性可使用受控压缩、牵拉、压痕、基底变形或局部机械刺激测定进行评估。当与钙成像、电生理学或神经肽释放测定配对时，机械刺激可帮助区分简单神经元活力与机械诱发的感觉活动。
**4.6. 神经免疫与神经血管功能评估**
天然皮肤内的感觉功能依赖于协调的神经免疫和神经血管通讯。激活的感觉神经元可通过神经肽释放调节炎症信号传导，而免疫来源的介质可调节神经元兴奋性、外周敏化和疼痛或瘙痒行为。因此，工程化感觉皮肤的功能验证不应仅询问神经元是否存在或具有电活动性，还应询问神经元活动是否能影响周围组织环境中的炎症和血管反应。神经免疫评估应包括可测量的炎症和神经源性输出。相关终点可包括细胞因子释放，如IL-1β、IL-6、TNF-α或IL-8；神经肽释放，如P物质或CGRP；肥大细胞激活标志物，如组胺或类胰蛋白酶释放；巨噬细胞极化标志物，如CD86或CD206；以及暴露于炎症介质后神经元响应性的变化。功能性神经血管评估同样重要，因为血管隔室影响神经元存活、代谢稳定性、炎症运输和营养信号传导。神经血管终点可包括内皮网络形成、血管样分支长度、管腔形成、内皮屏障完整性、血管通透性、VEGF相关信号传导以及神经元和血管结构之间的空间关联。
**4.7. 转化生理相关性与最小功能验证框架（MFVF）**
感觉皮肤工程中验证方法的显著异质性凸显了对更标准化方法的需求，以评估工程化组织内的神经能力。为解决这一差距，本综述提出了最小功能验证框架（MFVF），这是一个用于分类感觉能力工程化皮肤构建物中所实现功能表征水平的层级系统。MFVF的目的不是强加单一实验方案，而是帮助区分结构性神经整合、主动生理响应性和高级神经皮肤功能。Tier 1验证侧重于基础结构和生物学完整性。符合Tier 1标准的构建物应展示神经元存活、神经突延伸、细胞活力和工程化组织环境内空间整合的证据。典型评估包括免疫组织化学、神经突密度分析、神经元标志物表达、活力测定和基本形态学表征。Tier 1是必不可少的，因为它确认神经元能在构建物内存活和延伸突起；然而，它应被解释为结构整合的证据而非功能性感觉能力。Tier 2验证评估主动生理响应性。达到Tier 2的构建物应通过电生理记录、钙成像、刺激诱发去极化或机械转导评估展示动态神经活动。该层级包括单细胞和网络水平测定，如膜片钳电生理学、微电极阵列、钙成像和受控机械或化学刺激。Tier 2提供了比结构染色更强的证据，因为它显示整合的神经元具有活性和响应性。然而，除非刺激和响应与明确的感觉模态相关，否则Tier 2不一定确认完全的感觉相关性。Tier 3验证代表先进神经皮肤功能。达到Tier 3的构建物应展示模态特异性感觉行为、神经化学信号传导、神经免疫或神经血管通讯、表皮刺激反应或转化生理相关性。实例包括使用辣椒素、瘙痒原、炎症介质或受控机械变形进行受体靶向刺激；神经肽释放的定量，如P物质或CGRP；器官芯片系统中的分隔表皮刺激；以及评估神经元激活后的免疫或血管反应。Tier 3不应仅被解释为体内移植终点。先进的体外系统如果展示生理学上有意义的神经皮肤通讯，则可实现Tier 3功能，而评估移植物再神经支配和感觉恢复的移植研究则代表了额外的转化验证途径。
**4.8. 可重复转化的标准化功能基准测试**
随着工程化感觉皮肤系统变得更加复杂，标准化基准测试标准对于比较制造策略、评估转化就绪性和建立跨实验室的可重复质量控制标准将变得至关重要。当前细胞来源、生物材料选择、构建物结构、刺激范式、培养持续时间和验证方法的变异性使得难以比较研究报告的功能结果。这对感觉皮肤工程尤其重要，因为两个构建物可能都显示神经突生长，但在电生理活动、神经肽释放、机械感觉响应性、神经免疫信号传导或长期稳定性方面存在显著差异。未来的基准测试工作应因此包括多维评估而非单一终点。最低报告标准应包括细胞来源、神经元亚型身份、生物材料组成、刚度、降解行为、构建物几何形状、培养持续时间、刺激方法和定量功能读数。这些读数可包括神经突密度、轴突穿透深度、动作电位放电、钙反应幅度、响应神经元百分比、神经肽释放、机械激活阈值、细胞因子反应、血管通透性和长期活力。功能基准测试还应针对构建物的预期应用进行定制。
**5. 感觉整合的结构与生物材料决定因素**
**5.1. 感觉生物材料的设计要求**
将功能性感觉神经支配整合到工程化皮肤构建物中需要能够支持不仅细胞活力，
