《Advanced Drug Delivery Reviews》：From PEG to randomized PEG: a macromolecular strategy tackling PEG immunogenicity
PEG化是现代纳米医学中的关键策略，可提供有效且更安全的治疗药物。然而，患者中抗PEG抗体（APAs）的日益普遍已引发严重关注，多项研究表明APA形成与临床疗效降低及安全性风险相关。这已促成广泛共识，即需要开发下一代纳米医学解决方案，并推动了若干有前景的PEG替代品的开发。然而，针对某些替代聚合物结构的抗体已有报道。或者，在转向其他聚合物替代品之前，全面理解PEG的免疫原性及其临床影响具有高度相关性。因此，建议对免疫原性和分子识别模式进行详细考量，以指导下一代纳米医学的发展。为应对这些挑战，近期引入了随机化PEG（rPEG）技术，利用APA结构知识。随机引入“合成点突变”，即缩水甘油甲醚，破坏了PEG的规整性，同时保留了聚醚的关键性质。通过ELISA、MST和FCS分析证实了rPEG的抗原性降低。进一步的体外研究表明，rPEG无细胞毒性，不与血液相互作用，且不太可能激活补体。在纳米颗粒应用中，基于rPEG的聚合物胶束和脂质纳米颗粒分别表现出降低的抗原性以及与PEG化对应物相当的mRNA转染效率。最近的体内研究表明，在一系列PEG替代品中，rPEG-脂质体是唯一未表现出加速血液清除（ABC）现象的制剂，即使在经过PEG化脂质体交叉免疫后也是如此。尽管隐身性能需要进一步优化，rPEG代表了一种极具前景的PEG替代品。
1. 引言
PEG化已成为改善治疗药物药代动力学性质、稳定性和耐受性最广泛应用的策略之一。在过去几十年中，该方法推动了众多临床应用的PEG化药物的成功开发，涵盖广泛的治疗模式，使聚乙二醇（PEG）成为现代纳米医学的重要组成部分。然而，在治疗和未治疗人群中，抗PEG抗体（APA）的日益普遍对PEG化的效率和安全性提出了担忧。这一根本性挑战需要一方面更深入地理解PEG的免疫原性，另一方面开发PEG替代品，以在减轻不良反应的同时保留PEG化的益处。一种方法是最近引入的随机化PEG（rPEG）技术。本综述旨在全面概述rPEG作为传统PEG潜在替代品的前景，并有望直接替代。为此，我们首先简要总结PEG化的关键领域，讨论与APA相关的日益增长的挑战，随后重点介绍rPEG的化学性质、特性及其潜在应用。
1.1. PEG化
PEG化，即将聚乙二醇共价连接至生物分子、脂质、其他聚合物或小分子，其历史可追溯至近50年前，并在过去几十年中成为现代医学不可或缺的一部分。本章将简要总结PEG化的历史（章节1.1.1）并突出其最重要的应用和益处（章节1.1.2）。
1.1.1. PEG化的历史
1977年，Davis和Abuchowski开创性地将PEG共价连接至牛肝过氧化氢酶和牛血清白蛋白（BSA），并报道了改善的免疫学性质以及延长的循环时间。PEG化的概念迅速在科学和工业领域传播。这促成了Adagen?的开发，这是Enzon公司（由Davis和Abuchowski创立）于1990年推出的首个FDA批准的PEG化治疗药物，仅十年之后。此后不久，聚合物脂质DSPE-PEG2000使得Doxil?（Caelyx?）的开发成为可能，这是一种阿霉素脂质体制剂，于1995年成为首个FDA批准的PEG化纳米颗粒（NP）。除这两个突出例子外，PEG化已扩展到三个主要的医学应用领域：小分子（如RNA适体、肽和小有机分子）、蛋白质（包括酶、生长因子、干扰素、凝血因子、激素和抗体片段）以及纳米颗粒。截至2023年6月，这些广泛的应用领域已产生38种FDA批准的PEG化治疗药物，如Gao等人全面总结所述。仅在两年半内，又有六种PEG化药物（包括新药申请（NDA）和生物制品许可申请（BLA））获得FDA批准。这一趋势似乎证实了早期快速增长预测，到2026年3月，FDA批准的PEG化药物数量将增至44种，这一轨迹可能在未来十年进一步加速。
1.1.2. PEG化纳米药物
PEG化肽和蛋白质类药物，例如酶、生长因子、干扰素、凝血因子、激素和抗体片段，构成了FDA批准的PEG化治疗药物中数量最多的群体。许多知名专家为PEG化蛋白质的研究和发展做出了贡献，本节无法一一提及。Zalipsky和Pasut编辑的《聚合物-蛋白质偶联物——从PEG化及其超越》一书值得特别关注。该书全面概述了该技术的基本方面、与临床相关偶联物相关的免疫毒性问题以及若干新方法。另一个关键概述是Harris和Chess于2003年发表的综述“PEG化对药物的影响”。该卷解释了PEG化蛋白质药代动力学（PK）和药效学（PD）性质的影响。最突出的PK参数是延长的血液循环时间，其源于半衰期增加和全身清除率降低。例如，分支型40 kDa PEG-干扰素-α2a（IFN-α2a）偶联物（Pegasys?）的半衰期延长至65小时，而未偶联的IFN-α2a为3–8小时。改善PK的另一个重要例子是培非格司亭（Neulasta?）。培非格司亭，也称为PEG-G-CSF，是先前批准的非格司亭（Neupogen?，G-CSF）的PEG化偶联物。两种药物的蛋白质组分均为粒细胞集落刺激因子（G-CSF），用于治疗化疗引起的白细胞（中性粒细胞）减少。培非格司亭对患者而言是显著改进，每个化疗周期只需注射一次，而非格司亭需要每天注射。Fishburn讨论了PEG化总是涉及PK和PD之间的谨慎平衡。如上所述，PEG化通常用于改善PK。然而，由于空间干扰，PEG化也可能导致结合亲和力不期望的降低，从而降低PD。PD的损失可通过增加的PK来缓解，从而产生独特的PK-PD特征。平衡和最大化这种PK-PD特征对于先进的PEG化蛋白质至关重要。这些策略之一是仔细选择PEG化位点，即PEG化的氨基酸残基，从而防止阻断活性中心或高亲和力结合位点。在过去几十年中，已经建立了多功能的工具包，从非选择性赖氨酸到位点和氨基酸选择性PEG化以及高度特异的生物工程方法。
另一类高度相关的PEG化结构是基于PEG的嵌段共聚物。通常，这些是AB或ABA嵌段结构，PEG作为亲水性A嵌段。它们通常用作非离子表面活性剂以稳定生物制药或作为纳米载体组分，例如在胶束系统中。特别是两亲性ABA型三嵌段共聚物，如PEG-b-PPO-b-PEG（称为泊洛沙姆或Pluronics?），广泛用作药物制剂中的辅料。其低毒性、良好的生理性质以及增溶和稳定敏感API（包括蛋白质、酶和纳米颗粒）的能力使泊洛沙姆成为有用的药物辅料。在制剂中，泊洛沙姆主要用于抑制聚集、表面吸附和变性。例如，泊洛沙姆188（Pluronic? F68）广泛用于单克隆抗体、酶治疗药物和病毒载体的药物制剂中。类似地，含PEG的聚山梨酯，如Tween? 20和80，用作辅料以帮助在储存、运输和给药期间保持生物制品的稳定性。这两类辅料都受益于PEG部分提供的高水溶性。然而，由于可能的结构异质性或降解，需要仔细监测这些辅料在药物制剂中的使用。
基于PEG的嵌段共聚物在聚合物胶束（PM）中也发挥核心作用，特别是在靶向药物递送中。Kataoka在其全面综述中概述了用于药物递送的嵌段共聚物胶束的设计、表征和生物学影响。他总结道，两亲性嵌段共聚物（自）组装形成独特的核-壳结构是关键特征。多功能亲水性聚合物库可作为壳形成构件。在这些壳形成聚合物中，PEG是最突出的结构之一。然而，替代亲水性聚合物如聚（2-噁唑啉）/聚（2-噁嗪）（POx/POzi）、聚肌氨酸（PSar）和多糖也同样适用，如Kabanov和Luxenhofer的两篇综述所示。此外，Kataoka描述了具有两个主要目的的独特核心结构。一方面，核心分离是胶束化的主要驱动力，其依赖于疏水相互作用、静电相互作用、金属络合和氢键，取决于聚合物结构。另一方面，核心主要负责难溶性药物的增溶。然而，最近的几项研究挑战了这种长期观点，即疏水核心主要决定药物载量，而亲水性壳仅提供稳定化。如Luxenhofer综述中详细讨论的，亲水性壳也显著促进药物增溶。
PEG脂质，即PEG与各种脂质的组合，提供了下一个高度多功能的药物递送工具包。例如，它们对于PEG化脂质体和PEG化脂质纳米颗粒（LNPs）至关重要。在COVID-19大流行期间LNP取得突破之前，脂质体被认为是最成功的药物递送系统，主要归功于PEG化。Bozzuto和Molinari指出，非PEG化脂质体（称为“第一代”脂质体）出现于20世纪60年代，具有有前景的性质，包括增溶细胞毒性药物的能力。然而，它们也有显著局限性，特别是被网状内皮系统（RES）快速清除。在20世纪90年代，PEG化脂质体（称为“第二代”脂质体）作为克服第一代脂质体局限性的最有前景策略出现。PEG化增加了稳定性和循环时间，同时减少了RES清除。本质上，PEG化脂质体是长循环脂质体，也称为“隐身脂质体”。这些早期脂质体研究最终促成了Doxil?的开发及其于1995年获得FDA批准。Doxil?可能是最著名的PEG化脂质体。与许多后来开发的脂质体一样，Doxil?也通过EPR效应（增强渗透和保留）实现“被动靶向”。深入讨论PEG化脂质体的成功超出了本综述的范围。我们恳请读者参阅广泛的文献，并推荐Barenholz关于Doxil?背后故事的第一手印象。
在COVID-19大流行期间或之后不久，焦点从PEG化脂质体转向PEG化LNP作为治疗性mRNA的关键纳米载体。对有效控制措施的迫切需求导致首批基于LNP的mRNA疫苗的快速开发和授权。在2021年进入临床试验的50多种不同疫苗接种类型候选疫苗中，Moderna的mRNA-1273（Spikevax?）和BioNTech/Pfizer的mRNA BNT162b2（Comirnaty?）显示出最高的效力。Watson等人的数学模型研究估计，仅在它们施用的第一年（2020年12月8日至2021年12月8日），所有COVID-19疫苗接种合计挽救了1440万人的生命。这凸显了疫苗快速开发和分发对疫情进程的影响。除了mRNA疫苗开发必须面对的许多挑战外，将mRNA安全有效地递送至细胞质是其中之一。困难源于mRNA的高分子量、负电荷和不稳定性。人血清中的裸mRNA被快速降解，因此使用适当的载体系统至关重要。LNP通过掺入四种不同的脂质类型成功解决了这些问题：（i）可电离阳离子脂质含有氨基，在形成过程中与带负电的mRNA形成复合物，而（ii）中性磷脂在（iii）胆固醇的帮助下形成稳定的脂质双层。PEG脂质（iv）对LNP尺寸至关重要，尽管它们仅占LNP的1.5–2.0 mol%。此外，它们对于实现长期稳定性和防止聚集至关重要。与脂质体相比，“隐身效应”对LNP的作用较小。LNP通常含有较短烷基链（C14）的PEG脂质。这些PEG脂质的快速脱落促进淋巴免疫细胞摄取或蛋白质冠的积累，从而促进载脂蛋白E（ApoE）调理和肝细胞摄取。然而，使用更稳定锚定的PEG脂质（如DSPE-PEG）的LNP也可以表现出“隐身效应”。
尽管COVID-19 mRNA疫苗是含LNP制剂最突出的例子，但Onpattro?（patisiran）是首个于2018年获得FDA批准的PEG化LNP治疗药物。封装小干扰RNA（siRNA）使得成功治疗遗传性转甲状腺素蛋白诱导的淀粉样变性成为可能。除了这三种FDA批准的PEG化LNP系统外，目前还有更多正在进行临床试验，这可能导致不久的将来批准几种新的LNP治疗药物和疫苗。
1.2. PEG免疫原性
抗PEG抗体（APAs）已成为影响PEG化治疗药物效率和安全性的关键因素。本章首先概述APA日益普遍的现状（章节1.2.1），然后基于体内研究和临床试验讨论其相关不良反应（章节1.2.2）。接下来，回顾晶体学研究以阐明APA结合的分子识别模式（章节1.2.3）。最后简要总结最著名的PEG替代品（章节1.2.4）。
1.2.1. APA日益普遍
长期以来认为PEG具有免疫惰性，因为它是一种规整、线性的链，没有适合特异性识别的官能团，但这一观点早在1983年就受到Richter和?kerblom的挑战，他们表明PEG可诱导抗PEG抗体。在他们的研究中，他们使用mPEG修饰的卵清蛋白、牛超氧化物歧化酶和豚草花粉提取物衍生物免疫兔子。将这些PEG化蛋白质的免疫原性与天然蛋白质和游离mPEG进行比较。结果表明，游离PEG本身无或仅弱免疫原性，而共价偶联至蛋白质则产生PEG特异性免疫原性。此外，作者还强调了PEG免疫原性的复杂性，因为不同蛋白质和添加弗氏完全佐剂后抗PEG抗体反应有所不同。在随后的研究中，Richter和?kerblom（1984）分析了三个PEG化过敏原脱敏治疗临床试验的材料。他们报告说，第一和第二疗程后分别有50%和28.5%的患者产生了APA。这些APA被鉴定为主要是IgM同种型，反应弱至中等。鉴于这一点以及重复治疗没有APA加强效应，临床影响被认为不显著。此外，早在1984年，在从未接受过任何PEG化药物的健康供体中，预先存在的APA自然出现率高达3.3%。值得注意的是，在Doxil?获得FDA批准之前，就已经在正常人群样本中描述了第一批APA，这归因于与PEG的“环境接触”。最近的研究揭示了与1984年相比APA流行率的急剧增加。Lai团队于2016年发表了一项综合研究，分析了377份人血浆和血清样本中与年龄、性别和种族相关的APA滴度。令人惊讶的是，72%的人样本显示出可检测的抗PEG抗体水平。观察到大多为相当低的滴度，但7%和1%的所有样本的抗PEG IgG和IgM滴度分别高于500 ng mL
?1。此外，观察到年龄相关性，但无显著性别或种族相关性。在另一项研究中，Roffler及其同事报告女性患病率显著高于男性，在汉族人群（N = 1504，居住在台湾）中总体患病率为44.3%。据我们所知，Landfester团队报告了迄今为止最高的患病率，在德国人群中女性和男性分别为81.8%和74.4%。在COVID-19大流行结束时，Ju和Kent指出，PEG化LNP（mRNA疫苗）可诱导或加强人类抗PEG抗体。然而，他们也指出有必要进一步研究PEG特异性、疫苗反应原性以及对其他PEG化治疗药物影响的拟议联系。
1.2.2. APA的不良影响
APA的临床和体内影响是一个高度讨论和复杂的话题。获益-风险评估是药物开发的基本组成部分。涵盖APA不良反应的全部内容超出了本综述的范围。本章旨在强调一些与不良临床影响相关的APA研究实例。Ishida及其同事分析了培非格司亭（PEG-G-CSF）的免疫原性以及诱导的APA的潜在不良反应。培非格司亭，也称为Neulasta?（Amgen），是最重要的PEG化蛋白质之一（见章节1.1.2），并有多个FDA批准的生物类似药。Ishida基本上表明，重复施用培非格司亭会引起剂量依赖性免疫反应。此外，诱导的抗PEG IgM与第二剂量的加速血液清除（ABC）明确相关。然而，与临床静脉注射剂量相似的第二次注射并未引起ABC效应。尽管如此，癌症患者通常在治疗期间接受多次培非格司亭注射。因此，培非格司亭的ABC效应应被视为临床效率的潜在损失。2016年，一项Pegnivacogin（一种修饰的31核苷酸RNA适体，偶联至40 kDa分支mPEG）的2b期临床试验在三次严重过敏事件后终止。所有三名患者均表现出升高的IgG抗PEG抗体水平，表明PEG而非寡核苷酸是原因。然而，PEG过敏的确切机制仍不清楚。该研究观察到，预先存在抗PEG抗体的患者中，对Pegnivacogin的急性过敏反应仅发生，这些反应与补体激活和类胰蛋白酶释放相关。Sullenger的工作中提供了PEG化适体的进一步概述。作者明确强调了更好地理解抗PEG抗体及其临床影响的重要性。然而，他们也指出，70%的预先存在APA已经构成严重的安全隐患，如与PEG化治疗药物相关的首次临床试验终止所例证。如果APA患病率持续上升的趋势继续，则需要批判性地评估PEG化RNA适体疗法的使用和益处。此外，作者鼓励针对具有相关预先存在APA滴度的人类采用基于精准医学的方法。
PEG化纳米颗粒，如脂质体、LNP和聚合物胶束，在现代纳米医学中对增强药物递送至关重要，因为它们可以延长循环时间、改善溶解度和增强稳定性。然而，新兴的抗PEG抗体在所有类型的PEG化NP中引起了对免疫毒性、加速血液清除和严重不良反应的担忧。在全球COVID-19 LNP疫苗接种运动中，描述了罕见的严重过敏反应，怀疑PEG脂质是原因。Padín-González等人（2022）的综述重点关注PEG对纳米颗粒制剂的影响，特别是对COVID-19疫苗的影响。他们证明mRNA-LNP技术在不损害安全性的情况下迅速建立。然而，罕见的不良反应可能暂时归因于PEG化LNP，怀疑是由补体激活相关假过敏（CARPA）引起的。然而，这些不良事件的确切机制仍不清楚，没有确凿证据表明PEG是原因。对以色列使用BioNTech-Pfizer mRNA-LNP疫苗（Comirnaty?）的早期疫苗接种活动的分析显示，APA可以结合Comirnaty?，但亲和力显著低于对PEG化脂质体的亲和力。与DSPE-PEG2000（常见脂质体PEG脂质，两个硬脂酰C18脂质锚）相比，ALC 0159（Comirnaty? PEG脂质，两个肉豆蔻酰C14脂质锚）的更快脱落被怀疑是原因。此外，在研究组中观察到IgG而非IgM的增加，且无严重不良反应。相比之下，其他研究报告疫苗接种后抗PEG IgG和IgM增加。两项研究都强调，诱导或预先存在的APA不会损害疫苗接种效率，但APA的增加对随后注射PEG化治疗药物进入血液构成安全和效率风险。Wang等人批判性地指出，由于已知的预先存在APA的显著变异性，有限的人群研究存在局限性和不一致性。因此，识别和确定PEG-LNP特异性在实践中具有挑战性。因此，他们设计了一个使用Comirnaty? LNP的综合大鼠模型，模拟真实世界的疫苗接种方案，涵盖时间点序列和剂量变化。该模型揭示，临床相关的LNP制剂可诱导时间和剂量依赖性APA。Zhan、Zhang及其同事的研究也关注LNP-mRNA COVID-19疫苗的体内安全性和有效性。这些研究基本上表明，抗PEG抗体不会降低疫苗效力，甚至可能增加效力，但对高预先存在APA滴度的人类构成关键安全风险。
新兴的APA也引起了对PEG化聚合物胶束（PMs）免疫原性和ABC效应的担忧。Shiraishi和Yokoyama描述了PEG化PMs的有趣免疫原性行为，这与PEG化脂质体不同。因此，重要的是定义和区分ABC效应的“诱导”和“效应”阶段，即分别指APA的诱导和加速血液清除。PEG化颗粒可以在诱导阶段触发APA的产生，这不一定导致ABC效应。然而，ABC效应（效应阶段）需要APA的存在。Shiraishi和Yokoyama比较了两种基于PEG的PM，即PEG-b-聚（β-苄基-L-天冬氨酸）（PEG-b-PBLA）和PEG-b-聚（L-赖氨酸-DOTA-Gd）（Gd-胶束）。PEG-b-PBLA胶束在单次注射后诱导显著的APA IgM反应，该反应与DSPE-PEG和PEG-PLA交叉反应。相比之下，Gd-胶束未引起任何IgM反应。这些看似矛盾的结果支持了PEG本身应被视为半抗原的假说。事实上，Richter和?kerblom已经报道PEG具有半抗原性质而非免疫原性质。PEG-b-PBLA和Gd-胶束仅在其非PEG嵌段上不同：前者是疏水性PBLA嵌段，后者是亲水性聚（L-赖氨酸-DOTA-Gd）嵌段。因此，APA“诱导阶段”依赖于PEG化PM的疏水嵌段。在首次施用PEG-b-PBLA PM后评估“效应阶段”揭示了令人惊讶的行为。作为第二剂量施用PEG化脂质体显示出ABC效应。相比之下，重复剂量PEG-b-PBLA PM未表现出ABC效应。作者将这一现象归因于在等摩尔PEG剂量下，PEG-b-PBLA颗粒的数量是PEG化脂质体的十倍。合理的解释是，诱导的抗PEG IgM滴度仅足以清除较少数量的PEG化脂质体。总体而言，结果表明PEG化PMs不表现出ABC效应，或仅表现出可忽略的效应。然而，取决于疏水部分，PEG化PMs可诱导抗PEG抗体，并且这些APA已显示与各种PEG化颗粒交叉反应，从而威胁其效率和安全性。类似的交叉反应在泊洛沙姆P188（Pluronic? F68）中检测到，这是一种用作临床相关辅料的PEG-b-PPO-b-PEG嵌段共聚物。预先施用P188使PEG化脂质体阿霉素的抗肿瘤效率降低超过三分之一。Shiraishi和Yokoyama在2024年进一步解释了非PEG部分对PEG免疫原性的影响，提出了“抗原性扩展”的概念。本质上，游离PEG和PEG-b-PBLA的PEG部分均被抗体互补位识别。然而，这种结合不是很强，导致游离PEG的情况下快速解离。而在PEG-b-PBLA的情况下，非PEG部分与互补位附近的疏水氨基酸直接相互作用，从而提供额外的稳定性并增加亲和力。非PEG部分的这种直接参与被提议为“抗原性扩展”概念，并归因于PEG化偶联物的半抗原到免疫原的转变。
总体而言，根据PEG化治疗药物的使用情况，获益-风险评估至关重要。区分严重或慢性疾病的重复治疗与预防性健康措施（如疫苗接种）突出了关于抗PEG抗体的两个主要关注点。在慢性疾病治疗中，临床效率的损失可显著损害患者生命，但风险评估不应完全忽视。另一方面，对于接种健康个体，风险评估是最关键的，必须谨慎对待。
1.2.3. 从抗体识别到替代大分子策略
理解抗PEG抗体如何识别和结合PEG（一种没有特异性识别部分且具有高度规整乙二醇（EG）骨架的线性聚合物）对于设计基于聚合物结构的替代品至关重要。此类聚合物应理想地避免与现有APA交叉反应，并缺乏与PEG免疫原性相关的结构模式，从而降低诱导新的抗聚合物抗体的风险。因此，确定APA晶体结构为分子识别和替代品的合成开发提供了有价值的跨学科联系。Roffler及其团队发表了开创性贡献，使得理解和生产抗PEG抗体成为可能。他们开发了几种APA，既能识别PEG骨架，也能识别甲氧基末端基团。这项研究和对明确APA的获取为当前所有领域关于PEG化治疗药物抗体问题的跨学科研究奠定了基础。本段重点介绍最新的晶体学结果，特别是与PEG免疫原性相关的结构模式。Roffler对PEG免疫原性领域的重大贡献已在广泛文献中总结。
Lai及其同事通过确定骨架选择性APA（6.3）的晶体结构，鉴定了特定的PEG表位和可能的结合机制。晶体结构显示，一条卷曲的PEG链由两个抗PEG Fab分子的二聚复合物结合。更仔细的评估揭示，抗PEG Fab的互补位形成由Trp96密封的开放环结构。固定的PEG链围绕Trp96形成三个半圆形结构域，并附着在互补位的外表面。这将16个连续的EG骨架单元鉴定为PEG骨架表位，这与先前的抗PEG ELISA研究非常一致。进一步的点突变实验强调了环结构和Trp96作为关键氨基酸的必要性。八个突变Fab中，有七个（防止环形成或阻断环进入）导致无可检测的PEG结合。此外，作者提出了可能的结合机制。首先，Fab互补位中的开放裂隙促进初始PEG-Fab表面相互作用。这诱导构象变化，而Trp96关闭环并捕获PEG链。固定但高度柔性的PEG链开始与互补位外表面相互作用。这反过来通过将PEG链缠绕在环的外部部分来稳定和最终确定结合。总体而言，几乎没有发现氢键或其他特异性极性相互作用的证据。因此，范德华相互作用和表面面积的埋藏预计是稳定复合物的主要驱动力。
Lee、Roffler、Wang及其同事确定了另外两种骨架特异性APA Fab分子（3.3-Fab和2B5-Fab）的晶体结构。他们还揭示了一种二聚结构，其中一条PEG链结合两个单独的Fab分子。然而，确切的结合模式略有不同，因为PEG链在两个Fab分子之间形成围绕一个水分子的S形核心。此外，较长的PEG链可通过卫星结合位点稳定。这反映了为什么该复合物被称为核心-卫星结构。两项研究都突出了亲水性聚合物如PEG可被识别的结构模式。缺乏官能团和高度规整的结构是PEG骨架的主要特征，据信这些特征导致PEG的惰性。然而，正是这种规整性构成了识别的原因，即由16个连续EG单元组成的PEG骨架表位。此外，PEG的柔性是另一个分子特征，通过形成PEG链的环状结构（也称为冠醚（CR）样PEG结构）实现稳定结合。
APA对PEG识别的另一个重要方面是末端甲氧基，因为医学应用中主要使用具有α-甲氧基的mPEG。Sherman等人通过体内实验出色地评估了甲氧基在mPEG免疫原性中的不可忽视作用。用mPEG-、t-BuO-PEG和HO-PEG偶联物免疫兔子揭示，可以产生末端基团特异性抗体，而HO-PEG偶联物的滴度保持最低。用mPEG-尿酸酶免疫的动物对HO-PEG22-白蛋白的竞争比mPEG18-白蛋白低1300倍，如竞争性ELISA所分析。在这些结果的指导下，建立了“甲氧基特异性”或“末端基团特异性”APA的术语。然而，Sherman小组随后的出版物表明，单克隆和多克隆APA均不表现出绝对的“甲氧基”或“骨架”特异性，而是表现出相对选择性。为与文献中常用术语保持一致，我们将使用“特异性”一词，同时承认潜在的（m）PEG识别更准确地描述为相对选择性。
Su及其同事于2022年发表了首个甲氧基特异性抗mPEG APA（人源化15-2b）与mPEG的共晶结构。通过ELISA比较mPEG5000-NH2、HO-PEG5000-NH2和HS-PEG3500-NH2验证了h15-2b Fab的甲氧基特异性。只有mPEG5000-NH2显示出显著识别，而骨架特异性对照Fab（h6.3 Fab）识别所有三种聚合物。h15-2b-mPEG复合物的X射线晶体学揭示了不同的骨架以及不同的甲氧基相互作用。通过综合突变分析鉴定了两个相互作用位点的关键氨基酸残基。骨架相互作用分析显示，形成了两个冠醚（CR）样PEG结构，且PEG链被芳香族残基夹紧。突变分析还表明范德华力是骨架相互作用的主要驱动力，证实了Lai和Lee的先前结果。然而，也观察到聚醚氧原子与羟基或吲哚氮氨基酸残基之间氢键的迹象。四个疏水氨基酸残基（V37H、L89L、F98L、W104H）被发现靠近甲氧基。将这些残基突变为极性侧链揭示了三个方面。第一，所有四个都与甲氧基结合相关。第二，没有一个突变体具有强羟基特异性（HO-PEG）。第三，V37H和W104H被建议对甲氧基特异性至关重要。作者强调，有趣的是，这四个氨基酸（V37H、L89L、F98L、W104H）不仅与甲氧基结合相关，而且在抗PEG（3.3、2B5、6.3）和抗mPEG（h15-2b）抗体中高度保守。主要区别似乎是h15-2b的重链互补决定区3（HCDR3）较短。h15-2b较短的HCDR3使得这些保守残基成环，形成隧道样结构。甲氧基和mPEG的短连续骨架片段被捕获在h15-2b深处（VH:VL界面），有点像穿线。相比之下，骨架特异性APA的较大HCDR3阻断隧道样结构，形成开放表面。因此，抗体折叠的这种差异可合理地归因于甲氧基特异性。此外，这些结构差异可以解释为什么一个mPEG-APA（h15-2b）结合单条mPEG链，而两个骨架特异性APA形成桥接同型二聚体复合物，中央为PEG链。
考虑所有这些详细的晶体学研究，可以确定mPEG和PEG抗体识别中的几个关键分子模式。第一个模式是聚乙二醇骨架的规整性。这是所有用于生物偶联的均聚物面临的共同挑战。第二，范德华力似乎起关键作用，因为它们强烈依赖于距离。因此，聚合物与抗体之间的紧密接触是必要的。然而，也有氢键的迹象。第三，虽然聚合物链的柔性不是直接识别模式，但它对于稳定最终的聚合物-抗体复合物至关重要。在设计PEG替代品时，必须解决这些普遍的结构原则。
1.2.4. PEG替代品
在过去几十年中，对PEG免疫原性的认识激发了许多研究人员开发具有与PEG相当性质的替代聚合物。虽然这些替代品旨在实现类似目的，但它们表现出不同的结构差异。例如，聚（N-乙烯基吡咯烷酮）（PVP）、聚丙烯酰胺和聚（低聚（乙二醇）甲基丙烯酸酯）（POEGMA）基于乙烯基单体，因此由烃骨架组成。相比之下，一些替代品，如聚（2-噁唑啉）（POx）、聚（2-噁嗪）（POzi）、聚肌氨酸（PSar）和线性聚甘油（linPG），在其骨架中引入杂原子。此外，聚酯如聚磷酸酯（PPE）提供生物降解性。此外，两性离子聚合物如聚甜菜碱已报道具有有效的抗蛋白质吸附性能。重要的是要注意，一些PEG替代品已报道具有优异的生物相容性和出色的纳米医学性能。然而，这超出了本综述的范围，我们将不再详细阐述这些PEG替代品。相反，我们恳请读者参阅其他关于该主题的全面综述文章，其中展示了各自领域的出色工作，以及本期特刊中的其他文章。
在此背景下，我们还想讨论Marina Dobrovolskaia最近的评论，“知道你认识的魔鬼比不认识的好——纳米医学中的PEG挑战”（2025年）。她指出，PEG和纳米药物的免疫毒性仍缺乏全面理解。除了相关的知识增长外，几个方面仍不确定。因此，必须建立标准化方案，以全面理解各种制剂和给药途径中的抗PEG抗体。在放弃PEG之前，建议填补对PEG免疫毒性的理解空白。这种尚未完全获得的全面知识可以作为下一代“PEG化纳米药物”的指导，例如使用先进的PEG化制剂或PEG替代品。这些对PEG的考虑在提出的PEG替代品也并非免疫惰性的背景下具有高度相关性。Kierstead和Szoka检查了聚合物骨架如何影响聚合物脂质体中的ABC效应。在一系列PEG替代品中，他们观察到涂有聚（2-甲基-2-噁唑啉）（PMeOx）的脂质体在单剂量后引起强烈的抗PMeOx IgM反应，并在后续剂量中引起明显的ABC效应。Dahlman及其同事比较了LNP中PEG脂质和聚（2-乙基-2-噁唑啉）（PEtOx）脂质的使用。重复给药PEG化LNP导致严重的ABC效应和升高的抗PEG IgM滴度，如预期。有趣的是，重复给药PEtOx涂覆的LNP也导致与PBS对照和单剂量相比高度显著的ABC效应和抗PEtOx IgM。尽管PEtOx的效果不如PEG明显，但仍需仔细关注和进一步分析。这两项研究都表明POx并非免疫惰性。Ueda及其同事分析了PSar涂覆脂质体的免疫反应与PSar链长和PSar-脂质密度的相关性。他们的结果基本上表明PSar也并非免疫惰性，并诱导ABC效应以及轻微的抗PSar抗体滴度。因此，我们坚信PEG免疫原性的担忧也可以扩展到PEG替代品，如POx和PSar所示。因此，非常重要的是彻底检查每种潜在的PEG替代品，包括其反应途径（抗体依赖性和非依赖性），并评估毒理学风险。此外，如Dobrovolskaia所述，更好地理解APA对于优化和开发新的纳米载体至关重要。
2. 随机化PEG（rPEG）
随机化PEG（rPEG）的开发旨在解决对抗PEG抗体（APAs）日益增长的担忧，并提供传统聚乙二醇（PEG）的聚醚替代品。rPEG背后的概念是，破坏PEG的线性、高度规整的结构可以阻碍甚至完全禁用APAs的识别。最近的研究提供了对PEG抗体识别分子基础的详细见解（章节1.2.3）。这些研究表明，范德华相互作用和PEG链的固有柔性是稳定聚合物-抗体复合物的核心。这两个特征都促进了抗体对PEG的有效识别。基于这些发现，我们小组假设破坏PEG的结构规整性和线性将强烈影响其与APAs的相互作用。因此，我们设计了一种具有随机分布异构化的聚合物骨架，具体为亲水性甲氧基亚甲基侧链，从而在聚醚架构中引入“合成点突变”（图4）。所得聚合物rPEGs是PEG的构成异构体，保留了许多PEG的物理化学性质，但表现出大大降低的抗原性。在此背景下，重要的是要注意，乍一看，rPEG概念似乎与POEGMA相似，因为它依赖于大大缩短的PEG片段（图3）。然而，它们在合成和结构方面都有所不同。rPEG构成一种线性聚醚，其特征在于含氧骨架，通过阴离子开环聚合合成。相比之下，POEGMA通过受控自由基聚合生产，通常被认为具有瓶刷架构，具有纯烃骨架。
在保持PEG关键物理化学性质的同时，向聚醚骨架添加侧链可能会导致聚合物结构以及其合成、纯化和加工中微妙但重要的变化。对这些方面进行系统评估对于促进rPEG未来的靶向应用至关重要。以下部分概述了rPEG的结构特征（章节2.1）、关键合成路线（章节2.2.1）和相关聚合动力学（章节2.2.2），随后是rPEG的纯化策略（章节2.2.3），并系统讨论了所得材料特性，特别强调热性质（章节2.3.1）和水溶液行为（章节2.3.2）。
2.1. rPEG：PEG的构成异构体
环氧乙烷（EO）和缩水甘油甲醚（GME）的阴离子开环共聚产生统计共聚物P(EO-co-GME)，无论单体组成如何，它们都代表PEG的构成异构体。所得共聚物被定义为“随机化PEG”（rPEG），因为P(EO-co-GME)理想上具有随机性质（章节2.2），这通过详细的原位聚合动力学阐明，且其与PEG具有异构性。异构性质源于G
