病理技术员对兽医诊断、研究和教学的关键贡献

《Animals》：The Critical Contribution of Pathology Technicians to Veterinary Diagnostics, Research and Teaching

　　

罗氏沼虾（*Macrobrachium rosenbergii*）是全球淡水养殖中具有重要商业价值的甲壳动物，而由非O1霍乱弧菌（non-O1 *Vibrio cholerae*）引起的弧菌病已成为限制其可持续集约化养殖的主要瓶颈。维生素D₃（VD₃）是一种参与动物矿物质代谢和免疫调节的生物活性脂溶性营养素，但其对病原菌胁迫下罗氏沼虾生理反应的影响尚未明确。本研究配制了六种梯度VD₃浓度（0.10、0.18、0.28、0.48、0.68和0.88 mg/kg）的实验饲料，饲喂罗氏沼虾幼体（初始体重：2.06 ± 0.07 g）70天，随后进行72小时的非O1霍乱弧菌攻毒试验。结果表明，饲料中添加VD₃减轻了非O1霍乱弧菌诱导的虾肠道和肝胰腺组织病理损伤。VD₃补充以组织特异性方式显著调节抗氧化酶活性：肠道中超氧化物歧化酶（SOD）活性升高，而肝胰腺中过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性升高。然而，丙二醛（MDA）、总抗氧化能力（T-AOC）以及肠道GSH-PX或肝胰腺SOD未表现出显著反应，表明VD₃的抗氧化作用具有选择性而非全面性。同时，适量VD₃以组织特异性模式显著上调多个免疫相关基因（模式识别受体、抗菌肽和免疫效应因子）的mRNA表达，但部分抗氧化指标和免疫相关基因未出现显著反应。此外，VD₃补充显著调节了虾肌肉的某些理化参数，包括红度值、蒸煮损失和质构特性。基于所评估的生理指标，0.48–0.68 mg/kg的VD₃产生了最有利的整体反应。这些发现表明，饲料VD₃可能通过调节抗氧化能力和免疫相关基因表达来调控罗氏沼虾在细菌攻毒期间与宿主防御相关的生理反应，同时改善肉质。因此，VD₃是一种潜在的营养策略，用于改善淡水甲壳类养殖中细菌攻毒期间的健康状况。

**研究背景与问题**
全球水产养殖是增长最快的食品生产部门，为不断增长的人口提供优质动物蛋白。罗氏沼虾（*Macrobrachium rosenbergii*）因其生长快、肉质优、市场价值高，成为全球淡水甲壳类养殖的重要物种。然而，集约化养殖导致细菌性疾病爆发，尤其是由非O1霍乱弧菌（non-O1 *Vibrio cholerae*）引起的弧菌病，已成为限制其可持续发展的主要瓶颈。该病原体为革兰氏阴性机会致病菌，可导致虾肝胰腺坏死、肠道屏障破坏和免疫抑制，造成大量死亡和经济损失。目前抗生素仍为主要防控手段，但过度使用引发药物残留、生态破坏和公共卫生风险，亟需安全有效的替代方案。利用功能性饲料添加剂进行营养干预被认为是提高养殖甲壳类抗病力和生长性能的可持续策略。维生素D₃（VD₃）在脊椎动物中参与钙磷代谢和骨骼发育，近年来发现其具有抗氧化、先天免疫调节等非经典功能。在水生动物中，VD₃补充可改善多种鱼类和凡纳滨对虾（*Litopenaeus vannamei*）的生长、抗氧化能力和先天免疫，但相关研究主要基于非攻毒或环境胁迫条件，而非病原感染。甲壳动物虽无脊椎动物型骨骼，但其钙代谢与蜕皮周期紧密相关，且VD₃可影响中华绒螯蟹的蜕皮性能、组织钙磷沉积和免疫状态。然而，在病原感染条件下VD₃对罗氏沼虾的生理反应（尤其是组织特异性调控）尚不清楚。本研究旨在验证假设：饲料VD₃补充可通过增强抗氧化防御和调节先天免疫反应，减轻非O1霍乱弧菌攻毒诱导的组织损伤，改变罗氏沼虾肌肉理化性质。该研究发表在《Animals》。

**关键技术与方法**
研究人员从江苏高邮当地养殖场获取罗氏沼虾幼体（初始体重2.06±0.07 g），在江苏省淡水水产研究所扬中基地进行为期70天的饲喂试验。采用高效液相色谱法（HPLC）测定实际饲料VD₃浓度（0.10、0.18、0.28、0.48、0.68、0.88 mg/kg）。攻毒试验使用本实验室保存的非O1霍乱弧菌菌株，以腹腔注射方式对虾进行亚致死浓度攻毒（1×10⁴ CFU/只），72小时后采集肠道和肝胰腺组织。主要技术方法包括：苏木精-伊红（H&E）染色观察组织病理学；生化试剂盒检测丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）和总抗氧化能力（T-AOC）；实时荧光定量PCR（qPCR）检测免疫相关基因mRNA表达；质构仪分析肌肉剪切力、质构剖面、蒸煮损失和色度。样本来源为来自江苏高邮的养殖场。

**研究结果**
**3.1 虾肠道的H&E染色**
通过H&E染色评估不同VD₃水平下罗氏沼虾肠道组织病理变化。VD 0.10组肠道结构完全破坏，正常黏膜绒毛崩解，伴有水肿和明显炎性浸润；VD 0.18组黏膜绒毛塌陷、上皮细胞坏死脱落；VD 0.28–0.68组肠道整体结构完整，仅绒毛高度轻微降低及少量顶端上皮脱落；VD 0.88组出现绒毛萎缩、上皮细胞排列紊乱及少量炎性细胞浸润。
**3.2 虾肝胰腺的H&E染色**
肝胰腺组织病理观察显示，VD 0.10组肝小管拉长、扭曲、碎裂，伴有广泛上皮坏死和空泡变性；VD 0.18组小管紊乱、广泛空泡化和上皮脱落；VD 0.28和VD 0.88组小管松散、扩张变形，上皮细胞明显空泡变性；VD 0.48和0.68组肝胰腺结构完整，小管密集规则排列，上皮细胞保存良好。
**3.3 肠道和肝胰腺组织的酶活性**
膳食VD₃的抗氧化反应具有组织特异性和参数依赖性。肠道中仅SOD活性显著升高（VD 0.68组最高），而T-AOC、MDA和GSH-PX无显著变化；肝胰腺中CAT和GSH-PX活性随VD₃水平升高而显著增加（VD 0.68组最高），而SOD、MDA和T-AOC无显著差异。
**3.4 肠道和肝胰腺组织的基因表达**
肠道中，CLECT（C型凝集素）基因表达在VD 0.48组最高（2.08倍），ALF（抗脂多糖因子）mRNA在VD 0.48组峰值（2.42倍），SOD基因表达在VD 0.68组最高（2.86倍），ProPO（酚氧化酶原）在各VD₃补充组均显著上调（1.64–2.08倍），SCAR（清道夫受体）在VD 0.48组最高（2.09倍）；血蓝蛋白1、HSP70、NOS和LEC3无显著差异。肝胰腺中，CLECT在VD 0.48组最高（2.29倍），SOD在VD 0.48组最高（2.90倍），SCAR在VD 0.48组最高（2.56倍）；HSP70、血蓝蛋白1、LEC3和NOS无显著差异。
**3.5 虾肌肉的组织学和理化性质**
细菌攻毒后所有处理组肌肉均未出现严重组织病理损伤，但VD 0.48和0.68组肌纤维排列较对照组更规则，而VD 0.88组则出现肌间隙增宽和排列紊乱。肌肉理化性质方面，VD 0.48组肉色红度值（a*）显著高于其他组；VD 0.68组蒸煮损失最低；VD₃补充组肌肉的胶粘性、内聚性、弹性和回复性显著低于对照组，而剪切力、硬度和脆度无显著差异。

**讨论与结论**
讨论部分指出，VD₃补充与减轻组织病理损伤相关，可能通过增强抗氧化能力和先天免疫基因表达实现，但改善的营养状况、采食量变化等因素不能排除。抗氧化反应呈组织特异性，肠道SOD反应更明显，肝胰腺CAT和GSH-PX反应更强，且MDA含量无显著变化表明脂质过氧化水平未受明显影响。免疫相关基因表达上调提示VD₃在转录水平具有潜在免疫调节作用，但需要进一步验证其功能转化。肌肉理化性质变化中，VD₃降低了蒸煮损失并改变了质构参数，可能与抗氧化作用改善持水性能有关。研究局限性包括未直接测量VD代谢和VDR介导信号、仅评估转录水平免疫反应、仅使用单一病原体及单一时点采样、所有肉质检测基于熟肉。结论部分翻译：本研究结果表明，饲料中添加VD₃调节了非O1霍乱弧菌攻毒罗氏沼虾的若干生理反应，包括减轻肠道和肝胰腺组织病理损伤、以组织特异性方式调节抗氧化酶活性、上调某些免疫相关基因的mRNA表达，以及改变部分肌肉理化性质。基于所有指标的综合评估，0.48–0.68 mg/kg的VD₃水平在测试处理中表现出最有利的整体反应。这些发现凸显了VD₃作为功能性饲料添加剂的潜力，可能增强罗氏沼虾养殖中与宿主防御和产品品质相关的生理反应，并为进一步评估VD₃作为功能性饲料添加剂提供了初步证据。需要进一步研究确定长期效果并在商业养殖条件下验证最佳补充水平。