表达天蚕素AD的重组新城疫病毒对家鸽腹泻减轻及肠道健康改善的安全性与有效性

《Animals》：Safety and Efficacy of a Recombinant Newcastle Disease Virus Expressing Cecropin AD for Diarrhea Reduction and Intestinal Health Improvement in Domestic Pigeons

　　

腹泻和肠道发育受损是肉用家鸽雏鸽孵化初期的主要制约因素，导致生长性能下降并增加对抗菌药物的依赖。天蚕素AD（Cecropin AD, CAD）是一种广谱抗菌肽，具有针对细菌病原体的潜在活性，可能成为改善家禽肠道健康的替代策略。本研究评估了表达CAD的重组新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）rTS-CAD3在一日龄家鸽中的安全性和生物学效应。研究人员将家鸽接种rTS-CAD3、亲本株TS09-C或PBS，并监测生长性能、腹泻发生率、病毒RNA持续存在时间、炎症反应、肠道细菌丰度、肠道菌群组成、肠道形态及上皮屏障功能。rTS-CAD3未引起死亡，仅检测到短暂的病毒RNA，且未诱导过度的炎症反应。与TS09-C和PBS对照组相比，rTS-CAD3显著增加了体重增重和平均日增重，同时降低了腹泻发生率。重要的是，rTS-CAD3减少肠道大肠杆菌（*Escherichia coli*）丰度，重塑肠道菌群（降低变形菌门和埃希氏菌-志贺氏菌属，增加厚壁菌门和乳杆菌属），提高绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度比值，并增强occludin表达。上述发现表明，NDV载体介导的CAD递送可减少肠道细菌负荷、增加occludin表达并缓解家鸽腹泻。rTS-CAD3代表了一种基于抗菌肽的、有望减少家禽生产中自发性腹泻及对常规抗生素依赖的策略。

**论文解读：**

**研究背景与问题**
鸽肉营养丰富，高蛋白低脂肪，全球消费需求日益增长。然而，雏鸽早期肠道发育不成熟，易发生菌群过度生长、肠道微生态失调和环境应激，导致腹泻频发，成为肉鸽生产中的主要制约因素。当前控制腹泻主要依赖抗生素，但短生产周期内使用抗生素引发肉品残留和耐药性传播等担忧。抗菌肽（Antimicrobial peptides, AMPs）具有广谱抗菌活性和低毒性，被认为是抗生素的潜在替代品。天蚕素AD（Cecropin AD, CAD）是由天蚕素A和D结构域组成的杂合抗菌肽，已有研究表明日粮添加CAD可缓解仔猪大肠杆菌性腹泻并改善肠道健康，但其在家禽尤其是家鸽中的应用效果尚不明确。新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）已被广泛用作家禽多价疫苗载体，可有效表达外源蛋白。研究人员前期工作证实，表达CAD的重组NDV可减少小鼠皮肤创面细菌感染并促进愈合。基于此，本研究旨在评估重组NDV表达CAD（rTS-CAD3）在新生家鸽中的安全性，并探讨其对生长性能、肠道形态、紧密连接蛋白表达及肠道菌群的影响，为抗菌肽在肉鸽生产中的应用提供依据。

**研究内容与结论**
研究人员首先对rTS-CAD3进行病原性分析（通过最小致死剂量平均死亡时间MDT/MLD测定），随后在新生家鸽中进行安全性和有效性评估。安全性实验共使用150只新生白杂交肉鸽，分为rTS-CAD3、TS09-C亲本株和PBS三组，经鼻内接种，观察21天。结果显示，rTS-CAD3未引起死亡，病毒RNA仅在肺和十二指肠中短暂检测到（肺中3–12天，十二指肠前6天），随后消失；IL-6水平无显著变化，粒细胞集落刺激因子（G-CSF）在3天时轻度升高，6天时恢复基线，表明未诱导过度炎症反应。rTS-CAD3的MDT>168 h，与亲本株TS09-C一致，保持低致病性。在有效性评估中，rTS-CAD3组家鸽在12–21天多个时间点体重显著高于对照组，平均日增重（ADG）显著提高，腹泻评分≥2的比例在3天后下降，21天时降至0%，平均腹泻评分始终较低。与对照组相比，rTS-CAD3显著降低肠道大肠杆菌数量（6、12、18天时），16S rRNA基因测序显示，rTS-CAD3增加厚壁菌门（Firmicutes）和乳杆菌属（*Lactobacillus*）相对丰度，降低变形菌门（Proteobacteria）和埃希氏菌-志贺氏菌属（*Escherichia–Shigella*）丰度。组织学分析表明，rTS-CAD3显著提高十二指肠和空肠的绒毛高度，虽隐窝深度在十二指肠增加、空肠无变化，但绒毛高度/隐窝深度比值（V/C比）显著升高。免疫组织化学（IHC）和qPCR结果显示，rTS-CAD3显著增强occludin蛋白和mRNA在十二指肠和空肠的表达。这些结果共同表明，rTS-CAD3通过减少肠道细菌负荷、调节菌群、改善肠道形态和屏障功能，从而减轻腹泻并促进生长。

**主要技术方法**
本研究采用的关键技术包括：①病原性测定（MDT/MLD法）和病毒滴度测定（EID₅₀，Reed-Muench法）；②实时荧光定量PCR（qPCR）检测病毒载量和occludin mRNA表达；③ELISA检测血浆细胞因子（IL-6和G-CSF）水平；④16S rRNA基因V3–V4区高通量测序（Illumina NovaSeq 6000平台，QIIME2、R、LEfSe分析）评估肠道菌群组成；⑤组织学染色（H&E）和形态计量学分析（绒毛高度、隐窝深度、V/C比）；⑥基于培养的大肠杆菌计数（MacConkey琼脂平板）；⑦免疫组织化学（IHC）半定量分析occludin蛋白表达（Image-Pro Plus软件，IOD值）。样本来源：安全性评估使用150只新生白杂交肉鸽，有效性评估另用独立队列的150只同类型肉鸽，均经鼻内接种，实验持续21天。

**研究结果**
**3.1 rTS-CAD3在新生家鸽中的安全性评估**
通过21天监测，rTS-CAD3接种组无死亡，病毒基因组RNA在肺中3–12天、十二指肠中前6天短暂检出后消失，IL-6水平无显著变化，G-CSF仅在3天轻度升高后恢复，MDT>168 h，表明rTS-CAD3安全且未引起过度炎症。

**3.2 rTS-CAD3对新生家鸽生长性能的影响**
rTS-CAD3组在12–21天多个时间点体重显著高于对照组，ADG显著提高，腹泻阳性比例（评分≥2）在3天后下降，21天降至0%，平均腹泻评分持续较低，表明rTS-CAD3改善生长性能并减轻腹泻。

**3.3 rTS-CAD3对家鸽肠道菌群组成的影响**
rTS-CAD3显著减少肠道大肠杆菌数量（6、12、18天），16S测序显示厚壁菌门和乳杆菌属丰度增加，变形菌门和埃希氏菌-志贺氏菌属丰度降低，提示可改善肠道微生态平衡。

**3.4 rTS-CAD3对家鸽肠道形态和occludin表达的影响**
组织学显示rTS-CAD3显著提高十二指肠和空肠绒毛高度，V/C比升高；IHC和qPCR证实occludin蛋白和mRNA表达显著增加，表明肠道形态和屏障功能得到增强。

**讨论与结论**
讨论部分指出，NDV载体安全性关键考虑病毒致病力、组织嗜性、宿主年龄和免疫状态。本研究证实rTS-CAD3在家鸽中低致病且炎症反应轻微，符合安全要求。抗生素滥用问题促使开发非抗生素策略，rTS-CAD3通过体内表达CAD减少肠道大肠杆菌，提供了一种无需抗生素的肠道疾病控制方法。与直接补充外源肽相比，NDV载体可实现一次性鼻内接种后体内持续产生CAD，避免肽的纯化成本、胃肠道降解和重复给药问题，但需进一步优化喷雾递送和剂量。抗菌肽改善肠道健康的机制包括直接抑菌和调节菌群、增强屏障功能。rTS-CAD3增加乳杆菌属，可能通过产有机酸抑制机会致病菌；增加厚壁菌门、改善绒毛形态和上调occludin，提示肠道形态和紧密连接改善。尽管微生物组分析每组仅3个样本，属探索性结果，但整体证据支持NDV载体递送CAD的实用性。研究结论总结：在实验条件下，rTS-CAD3对新生家鸽安全，改善生长性能并减少腹泻，相关机制包括降低肠道大肠杆菌丰度、改变菌群组成、改善肠道形态和屏障健康。研究认为NDV载体可作为家禽生产中抗菌肽递送和肠道健康改善的有前景平台。该研究发表在《Animals》期刊。