基于抗体筛选方法组合的工艺用水中嗜肺军团菌鉴定与定量分析

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Combination of antibody-based screening methods for the identification and quantification of Legionella pneumophila in process water

　　

摘要翻译：军团菌病是一种严重且常致命的肺炎，主要由吸入含有水生病原体嗜肺军团菌血清群1型污染的气溶胶引起。尽管传统的基于培养的检测方法通常是监测蒸发冷却系统的标准方法，但所需的10天培养周期延误了必要的风险评估。为克服这一时间障碍，研究人员采用了一种新颖的方法，将基于流动的化学发光夹心微阵列免疫分析（CL-SMIA）与冷冻保存的嗜肺军团菌标准品相结合，用于快速且不依赖培养的血清分型。该微阵列包含九种单克隆抗体和一种多克隆捕获抗体，成功地在每100 mL低至10⁵个总细胞的浓度下表征了高毒力的庞蒂亚克群，并在较低浓度下特异性鉴定了高传染性的费城亚型作为庞蒂亚克群的一个菌株。然而，直接亚型分型仍存在一些局限性。为应对这一挑战，研究人员开发了一种将免疫磁分离和流式细胞术与化学发光夹心微阵列免疫分析相结合的新型工作流程。由于流式细胞术定量后细胞活力得以维持，细胞可随后进行短暂培养，单菌落可用于亚型分型。与之前一样，研究人员使用冷冻保存的嗜肺军团菌标准品，向含有四种不同亚型复杂混合物的真实工艺水样品中进行加标。这种组合方法展示了诊断敏感性，并成功缩短了总处理时间。该方法能够在真实且复杂的工艺水基质中，实现对嗜肺军团菌的精确早期定量，以及在达到或超过行动限值时进行详细亚型分型。

论文解读文章

**研究背景与问题**

军团菌属（*Legionella* spp.）是自然和人工水系统中普遍存在的水生病原体，其中嗜肺军团菌（*Legionella pneumophila*, *L. pneumophila*）是引起军团菌病的最主要病原体。军团菌病是一种严重肺炎，病死率可达10%–15%，而庞蒂亚克热则表现为较轻的流感样症状。蒸发冷却系统（evaporative cooling systems, ECS）是军团菌大规模爆发的主要来源，因其可远距离释放生物气溶胶。欧洲多国（包括德国）设定了军团菌的行动限值为每100 mL 10,000菌落形成单位（colony-forming units, CFU）。官方检测方法基于培养（ISO 11371），耗时长达10天，仅能检测可培养细胞，且劳动强度大。当超过行动限值时，还需进行血清分型。嗜肺军团菌可分为15个血清群（serogroup, Sg），其中Sg 1可进一步分为庞蒂亚克群和非庞蒂亚克群，前者包含Knoxville、Philadelphia、Allentown/France等菌株，后者包含Bellingham、Camperdown、OLDA、Oxford等菌株。菌株鉴定依赖于细菌外膜脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）与单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）的反应模式，依据德累斯顿小组（Dresden Panel）通过间接酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）进行。流行病学数据表明，仅与mAb 3/1阳性反应的庞蒂亚克群菌株具有最高毒力相关风险。因此，快速识别ECS中的庞蒂亚克菌株对于风险评估和疫情调查至关重要。

**研究目的与现有方法的局限**

既有研究开发了基于流动的化学发光夹心微阵列免疫分析（flow-based chemiluminescence sandwich microarray immunoassay, CL-SMIA）用于嗜肺军团菌Sg 1的菌株分型，其芯片上印有九种mAb和一种多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb），对应LegioTyper面板。然而，该面板最初使用培养的嗜肺军团菌（浓度10⁷ CFU/mL）进行表征，在较低浓度（但仍超过行动限值）下的性能尚不明确。此外，CL-SMIA本质上是一种定性方法，缺乏定量信息，且多种Sg 1亚型混合会导致重叠的信号模式。为克服这些挑战，研究人员将免疫磁分离-流式细胞术（immunomagnetic separation coupled with flow cytometry, IMS-FCM）与CL-SMIA结合，形成一种新型工作流程。IMS-FCM是一种快速定量方法，可在复杂水基质中选择性定量嗜肺军团菌Sg 1–15，整个过程在rqmicro.COUNT设备中全自动完成，使用一次性微流控卡盒。定量后，阳性废液中的细胞可被收集并进行短暂培养，随后用于CL-SMIA亚型分型。

**研究内容与关键发现**

研究人员首先评估了CL-SMIA在不依赖培养条件下的性能，使用冷冻保存的嗜肺军团菌标准品（具有明确的完整军团菌计数和总军团菌计数）在三个独立实验室（慕尼黑工业大学、德累斯顿工业大学、巴伐利亚健康与食品安全局）进行测试。通过定义抗体特异性阈值（CL_th）和双倍阈值（2?CL_th），对空白信号进行统计分析，建立了信号判定标准。结果表明，在10⁴ TLC/100 mL浓度下，仅费城亚型可被检测（mAb 48/3、81/2和pAb呈阳性），且可归为庞蒂亚克群；在10⁵ TLC/100 mL浓度下，嗜肺军团菌Sg 1检测准确率达91%，mAb 48/3区分庞蒂亚克群与非庞蒂亚克群的准确率达95%；在10⁶ TLC/100 mL浓度下，Sg 1检测准确率提升至97%，且Benidorm（92%）、Knoxville（100%）、Philadelphia（75%）和Bellingham（75%）可实现亚型鉴定。然而，Camperdown、OLDA和Oxford的信号高度重叠，无法可靠区分，因此被归为COO组。

随后，研究人员将IMS-FCM与CL-SMIA结合，采用基于菌落的样品制备方法。将真实工艺水（来自AquaConcept公司）加标四种不同亚型（总浓度10,000 ILC/100 mL），经IMS-FCM定量后，收集阳性废液涂布于BCYE琼脂平板，培养4天后挑取单菌落，经流式细胞术调整至10⁷ cells/mL，再注入LegioTyper进行CL-SMIA分析。结果显示，随机挑取的38个菌落中，36个白色菌落被鉴定为嗜肺军团菌Sg 1，2个橙色菌落为非军团菌种。所有36个Sg 1样本均可明确归入庞蒂亚克群或非庞蒂亚克群，且通过模式分析实现了完全分型。该方法在4天内完成定量和亚型鉴定，定量结果可在2小时内获得。

**研究结论与意义**

本研究证实，冷冻保存的嗜肺军团菌标准品可作为方法开发的通用工具，适用于定性（CL-SMIA）和定量（IMS-FCM）两种工作流程。CL-SMIA可在10⁵ TLC/100 mL浓度下实现不依赖培养的庞蒂亚克群与非庞蒂亚克群区分，在10⁶ TLC/100 mL浓度下可实现部分亚型鉴定。结合IMS-FCM后，通过短暂培养和单菌落分析，可对复杂工艺水样品中的混合亚型进行精确鉴定。该组合方法弥补了传统培养法（耗时10天、低估VBNC细胞）、乳胶凝集法（无法区分庞蒂亚克群）和序列分型（SBT，耗时3–5天、成本高）的不足，提供了一种快速、灵敏、成本效益高的风险评估工具。在常规监测中，仅需挑取5–10个菌落即可筛查高传染性庞蒂亚克群；在疫情调查中，可扩大采样深度进行溯源。该研究为军团菌监测和风险防控提供了新的技术方案，具有重要的公共卫生意义。

**主要关键技术方法**

1. **化学发光夹心微阵列免疫分析（CL-SMIA）**：基于聚碳酸酯芯片，微接触打印九种单克隆抗体和一种多克隆抗体作为捕获抗体，采用流动注射和化学发光检测，在LegioTyper平台上34分钟内自动完成，通过信号模式区分血清群和亚型。
2. **免疫磁分离-流式细胞术（IMS-FCM）**：使用rqmicro.COUNT设备，通过磁珠标记抗体和荧光标记抗体选择性提取并定量嗜肺军团菌Sg 1–15，全过程自动化，定量后细胞存活。
3. **基于菌落的样品制备**：将IMS-FCM阳性废液涂布BCYE琼脂平板，培养4天后挑取单菌落，经流式细胞术计数并调整至10⁷ cells/mL，再用于CL-SMIA分析，实现混合菌株的分离和纯化。
4. **阈值定义与统计分析**：基于108次空白测量建立CL_th和2?CL_th，通过归一化信号比值（R）判定阳性/阴性，确保特异性。

**讨论与结论**

研究结果表明，CL-SMIA在10⁵ TLC/100 mL浓度下可区分庞蒂亚克群与非庞蒂亚克群，但直接亚型分型存在局限（如COO组无法区分）。通过结合IMS-FCM和短暂培养，单菌落分析解决了混合亚型重叠模式的问题，实现了精确分型。该组合方法在4天内完成定量和亚型鉴定，优于传统培养法（10天）和SBT（3–5天），且成本低于SBT，操作简便。研究还指出，mAb 3/1（用于ELISA的毒力标志物）在芯片上无法固定，因此使用mAb 48/3作为替代，两者靶向相同抗原。未来可通过更换特异性更强的捕获抗体来消除COO信号重叠。总体而言，该工作流程可灵活应用于常规监测和疫情溯源，为军团菌风险评估提供了高效工具。