《Biologicals》：Development of a novel competitive ELISA method for Typhoid Vi Polysaccharide Quantitation
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摘要市面上的伤寒疫苗含有Vi多糖（ViPS），这是沙门氏菌伤寒亚种的荚膜抗原，可呈游离状态存在，也可与破伤风类毒素、白喉类毒素以及交叉反应物质197等载体蛋白结合。在疫苗研发过程中，由于ViPS与固相的吸附能力较弱，导致传统ELISA方法的检测灵敏度较低，因此难以对其含量进行准确
摘要
市面上的伤寒疫苗含有Vi多糖（ViPS），这是沙门氏菌伤寒亚种的荚膜抗原，可呈游离状态存在，也可与破伤风类毒素、白喉类毒素以及交叉反应物质197等载体蛋白结合。在疫苗研发过程中，由于ViPS与固相的吸附能力较弱，导致传统ELISA方法的检测灵敏度较低，因此难以对其含量进行准确测定。我们开发了一种新型竞争性酶联免疫吸附试验（c-ELISA），以生物素化的ViPS作为检测探针来定量分析ViPS。该试验的性能通过世界卫生组织推荐的Hestrin比色法以及高效阴离子交换色谱法结合脉冲安培检测技术进行了评估。结果显示，c-ELISA与这两种方法在特异性、准确性和重复性方面表现相当，但在检测伤寒疫苗中游离多糖的含量时，c-ELISA的灵敏度更高，检测范围为90-10,000纳克/毫升。总体而言，这种新开发的c-ELISA是一种可靠且灵敏的免疫化学方法，可用于ViPS的定量分析，能够与HPAEC-PAD方法相互补充。二者结合可作为一种有效的分析手段，用于监测伤寒疫苗生产过程中的ViPS含量，并确保产品质量。
引言
由沙门氏菌肠炎亚种伤寒血清型引发的伤寒，在低收入和中等收入国家仍是一个严重的公共卫生问题，据估计每年有920万例病例，11万人死亡[1]。Vi多糖是一种由α-1,4连接的结构的单糖重复单元构成的线性同聚物，其第三个碳原子上具有可变程度的O-乙酰化修饰，是伤寒疫苗中的主要保护性抗原。市面上的伤寒疫苗有两种形式：一种是以游离ViPS为成分的疫苗（如），另一种则是将ViPS与各类载体蛋白结合的疫苗（如 [Vi与破伤风类毒素结合]、TYPHIBEV? [Vi与CRM197结合]、SKY-Typhoid? [Vi与白喉类毒素结合] [[2], [3], [4], [5]]）。对于含结合型ViPS的疫苗来说，准确测定其中的总ViPS含量以及游离ViPS含量对于工艺监控、产品放行以及稳定性测试至关重要[6]。
监管机构要求将ViPS含量测定作为重要的质量控制指标，通常采用HPAEC-PAD方法进行检测[5]，或者使用抑制ELISA、夹心ELISA[7,8]以及Hestrin法[9]等免疫化学方法。Hestrin法是通过测定多糖中的O-乙酰基含量来间接估算ViPS含量的。而HPAEC-PAD法则利用强酸或强碱使Vi链解聚，再通过离子交换色谱法结合参考标准ViPS来测定单体含量。现有研究中使用的抑制ELISA方法的检测范围为1-32微克/毫升[7]。为克服抑制ELISA灵敏度较低的缺陷，人们开发了夹心ELISA方法，但该方法需要使用自行研发的单克隆抗体，不仅耗时而且成本较高[8]。除了总ViPS含量外，游离多糖的含量对于伤寒结合疫苗而言也极为重要，因为它能够反映疫苗的结合效率及稳定性，其合格标准通常为总多糖含量的20%以下。因此，为了实现ViPS的准确定量，就需要一种灵敏度极高且精确度良好的检测方法，以便在低浓度下检测游离多糖，从而满足产品放行的要求[10]。
为解决现有分析方法在灵敏度和可靠性方面的不足，我们利用市售的多克隆抗血清开发了一种竞争性酶联免疫吸附试验（c-ELISA）。考虑到传统ELISA方法中Vi多糖的结合效率本来就较低，为了提高检测灵敏度，我们设计并优化了一种特殊的检测探针——ViPS-ADH-生物素（即生物素化的Vi多糖，其ViPS与生物素之间通过己二酸二肼作为双功能连接剂相连）。这种探针的引入显著提升了检测灵敏度，使得ViPS的定量更加准确。本研究介绍了这种c-ELISA方法的开发过程及其性能验证结果，并将其与现有的HPAEC-PAD法以及Hestrin法进行了比较分析。
内容片段
参考标准与ViPS样品
为进行定量分析，我们准备了两种内部参考标准：一种是源自纯ViPS的多糖内部参考标准（PS-IRS），另一种则是代表ViPS与白喉类毒素结合物的结合型内部参考标准（Conj-IRS）。PS-IRS的含量是参照世界卫生组织的伤寒ViPS参考标准（NIBSC，编号16/126，浓度为1毫克/毫升），通过HPAEC-PAD方法进行校准的。随后，通过将Conj-IRS与已校准好的PS-IRS进行比对，确定了其在0.5毫克/毫升浓度下的数值。
校准：PS-IRS与Conj-IRS
通过HPAEC-PAD方法，以世界卫生组织-NIBSC制定的国际ViPS参考标准为基准，对PS-IRS进行了校准，六次重复检测后的平均ViPS浓度为1034.11微克/毫升，标准差为22.5，相对变异率为2.2%。NIBSC提供的ViPS校准曲线呈现线性关系，R2值为0.9997。作为对照方法的Hestrin法检测显示，当PS-IRS浓度分别为1000微克/毫升、500微克/毫升和250微克/毫升时，其回收率分别为113%、102%和105%。基于Hestrin法的结果
讨论
准确测定伤寒疫苗中总ViPS含量和游离ViPS含量，是确保产品放行以及维持疫苗质量的重要指标。根据相关监管规定以及疫苗制造商的要求，每剂伤寒疫苗中ViPS的添加剂量为25微克/剂（每剂疫苗体积为0.5毫升）[[24], [25], [26]），且游离ViPS含量不得超过该剂量的20%[13,27]。因此，若能有一种灵敏度足够高的分析方法，能够在小于5微克/毫升的浓度范围内准确检测游离ViPS含量，那将对产品放行以及后续的质量控制工作非常有帮助。
结论
综上所述，我们开发的c-ELISA方法是一种灵敏、精准且可靠的检测手段，可用于测定无论是游离状态还是结合状态的伤寒疫苗中的总ViPS含量和游离ViPS含量。将该方法与现有的HPAEC-PAD方法结合使用，能够进一步提升伤寒疫苗制造商的分析能力，同时也能满足监管机构对于多种分析方法交叉验证的要求。除了用于产品放行检测外，c-ELISA还可作为过程检测工具，帮助优化疫苗的生产工艺。
作者贡献说明
Ashwani Kumar Mandyal：概念构思、数据整理、实验研究、方法设计、结果验证、初稿撰写、论文修订。Rajasekaran Angannan：数据分析、方法设计、论文修订。Balananda Dhurjati Kumar Putcha：数据分析、方法设计、论文修订。Charles David：项目监督、论文修订。Tarun Sharma：概念构思、项目管理、论文修订。
利益冲突声明
所有作者声明，他们不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益关系或个人关联关系。
致谢
我们衷心感谢印度海得拉巴的Auro Vaccines Private Limited公司对本研究提供的支持。同时，也要感谢Pradeep kumar Gupta博士和Chandreshwar Shukla博士提出的宝贵意见和修改建议，这些帮助我们提升了手稿的质量。此外，我们还要感谢ChatGPT（大型语言模型）在协助我们修改手稿部分内容方面的帮助，这些修改提升了文本的清晰度、一致性以及整体的科学逻辑性。
Ashwani Kumar Mandyal|Rajasekaran Angannan|Balananda Dhurjati Kumar Putcha|Charles David|Tarun Sharma
印度安得拉邦贡图尔县瓦德拉穆迪，Vignan's Foundation for Science, Technology and Research生物技术部门，邮编522213
