《Biologicals》：Pyrogen testing 2.0: Ethical, evolving and eco-friendly - Implementing safe, rapid, state-of-the-art and sustainable non-animal approaches worldwide. A meeting report
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家兔热原试验（RPT）自20世纪40年代起作为药品质量控制（QC）的基石，依靠家兔静脉注射后发热反应检测内毒素与非内毒素热原，但其高变异性、与人生物学相关性有限及灵敏度不足促使研究人员寻求基于机制的替代方法。欧洲药典委员会于2024年6月通过修订57个专论删除
家兔热原试验（RPT）自20世纪40年代起作为药品质量控制（QC）的基石，依靠家兔静脉注射后发热反应检测内毒素与非内毒素热原，但其高变异性、与人生物学相关性有限及灵敏度不足促使研究人员寻求基于机制的替代方法。欧洲药典委员会于2024年6月通过修订57个专论删除RPT并新增热原性通则5.1.13，2025年7月1日补遗11.8实施，2026年1月1日完全删除2.6.8章，标志向体外（in vitro）系统转变。单核细胞活化试验（MAT）可人源相关地检测全谱热原，欧盟成员国RPT使用从2015年14国降至2024年9国，家兔使用量减少67%。欧洲药品质量管理局（EDQM）与欧洲动物试验替代方法合作组织（EPAA）于2026年2月25—26日在布鲁塞尔召开国际会议，汇集监管者、工业界及多洲视角，评审RPT淘汰进展、替代技术进展与全球协调挑战。会议表明MAT、细菌内毒素试验（BET，含鲎试剂LAL/东方鲎试剂TAL或重组因子C（rFC））及重组级联试剂（rCR）构成新一代非动物热原检测体系；美国药典（USP）、中国药典（ChP）、日本药典（JP）、印度药典（IP）、韩国药典（KP）均分阶段引入MAT或rFC。研究人员指出MAT基于人单核细胞NF-κB信号与IL-6等介质定量，报道细胞系（如THP-1 NF-κB）降低批间变异；rFC避免鲎血采集，生态与供应优势明显。监管端EMA 3Rs工作组推动新方法（NAMs）资格认定，FDA依21 CFR 610.13仍列RPT但接受MAT替代，Health Canada视MAT为“替换”而非“比较”。结论为RPT全球淘汰在即但未完成，风险分级策略（仅内毒素风险用BET，存非内毒素热原风险用MAT）已成共识，非内毒素热原（NEPs）参考品与药典协调是剩余障碍。
研究背景方面，家兔热原试验（RPT）自1940年代起嵌入药物质量控制（QC），虽检测谱广但存在高变异性、人相关生物学意义弱及灵敏度受限等科学约束，且与欧洲3R原则（替代、减少、优化）及废止动物试验义务相悖。近期欧洲药典（Ph. Eur.）删除RPT（2026年1月1日删2.6.8章，2025年7月1日补遗11.8实施57专论修订并生效5.1.13热原性通则）加速转型，单核细胞活化试验（MAT）因基于人单核细胞激活NF-κB与产生IL-6等介质，可检全谱热原，成为核心替代。研究人员由EDQM与EPAA于2026年2月25—26日在布鲁塞尔组织国际会议，汇总监管、工业、多国药典机构证据，回答RPT如何淘汰、MAT与重组内毒素试剂如何落地、全球协调缺口何在。论文发表于《Biologicals》，意义在于给出截至2026年初的非动物热原检测（pyrogenicity testing）路线图与监管实践样本。
关键方法上，研究人员采用会议报告形式整合监管文件与产业验证数据：其一，基于药典修订时间轴（Ph. Eur. 2.6.8撤销、5.1.13新增、2.6.30/2.6.40 MAT、2.6.32 rFC、USP <85>/<86>/<151>）做制度梳理；其二，工业界以产品特异性验证（ICH Q2(R1)、USP <1032>/<1033>）汇报MAT两种模式——方法1（LPS参照限测试）与方法2（参比批定量比较），及rFC/rCR与LAL桥接比对；其三，样本队列来自MSD疫苗（含脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白复合物OMPC）、Sanofi/GlaxoSmithKline（GSK）Bexsero（含OMV）、Roche三类产品性能确认批，及多国对照品（LPS、脂磷壁酸、鞭毛蛋白、肽聚糖）；其四，细胞模型覆盖人外周血单核细胞（PBMC）池、THP-1 NF-κB报道细胞、Mono Mac-6、U937、HL-60；其五，监管端用NC3Rs 2025年21国49份问卷与IMRWG3Rs（国际药品监管者3R工作组）案例交换作循证。
研究结果按原文小节浓缩如下。
2 淘汰RPT：EDQM经2022年战略文告推路线图，欧盟40签署方中RPT仅例外临时留存；EMA Filipa Sameiro指明删RPT后若已有BET无须回溯评估，缺方法则按风险加方法，BET替RPT为IB类变更，MAT为II类；Sonja Beken述3RsWP 2022年建组，推新方法（NAMs）资格程序。工业界Sijia Yi（MSD）用THP-1 NF-κB荧光素酶MAT替OMPC疫苗RPT，R2≈0.99；Emmanuelle Coppens（Sanofi）2013—2024年QC动物用量降约85%，新产物仅内毒素风险用rFC放行、MAT作一次性表征，固有热原疫苗用参比批MAT，全面废RPT延至2029；Shahjahan Shaid（GSK）2025年完成废RPT，靠过程一致性+BET+rFC/ LAL+MAT三层。区外：USP Leslie Furr指13个USP专论仍引RPT，21 CFR 610.13(b)强制兔静注，USP 2025—2030计划评MAT；中国NIFDC Qing He称ChP 2025版89%用LAL/TAL-BET、10%仍RPT，3309/RGA、9301/MAT、9251/rFC为补充，2035年前转替代；JP Katsuhiko Hayashi称JP19通用信息G4-13-190（2026年4月10日公布）列MAT，国立生物制品检自2024年停RPT；印度Anil Kumar Teotia称IP 2026化学品多转BET、生物制品77个仍部分留RPT；韩国Hokyung Oh称KP 2023年9月入rFC、2025年3月入MAT，MFDS用PBMC/THP-1/U937/HL-60做血液制品替代验证。面板会Cynthia Allen（Health Canada）提MAT是“substitution”非“replacement”，FDA Simleen Kaur等认MAT但老产品换法需21 CFR 610.09(a)可比性。
3 单核细胞活化试验：Stéphanie Richard（Sanofi）用4供体PBMC孵育20—22 h测IL-6（ELISA/HTRF），法1 LPS参照法2参比批，自动化省1.5 h；Liliana Alleri（GSK）Bexsero用OMV剂量响应平行线法，多供体几何均数报告；Sven Deutschmann（Roche）通用验证+产品验证，回收率50—200%，FDA受MAT替RPT但美申报仍作替代；Johannes Reich（Microcoat）强调MAT经TLR4检内/非内毒素而BET仅内毒素；Barbora Ladinova（SUKL）称欧指南风险分级，MAT首选、RPT仅极例；Cynthia Allen谓Mono Mac-6减供体变异；Ingo Spreitzer（PEI）溯2002年首例MAT批准（PBMC+IL-6检出发酵污染），2002—2006两国际验证超1000盲样，新方向含诱导多能干细胞巨噬、CRISPR单核细胞。面板会NC3Rs调查指成本/细胞获取/技能是MAT采纳屏障，1 EE（内毒素当量）定义为诱发同量IL-6读数如1 IU/mL内毒素参照，CLC（污染物极限浓度）与ELC对齐。
4 重组内毒素试剂：Abdelmoughit Kaoukab Raji（GSK）转rFC需桥接LAL，欧为IB类美为补充；Catrina Stirling（AnimalHealthEurope）兽医界因供应链与生态推rFC/rCR但全球未协调；Jay Bolden（Eli Lilly）10产品获准用重组 assay；Barbora Ladinova谓欧BWP拟将rFC由II类降至IB类；Leslie Furr与Emmanuelle Charton谓Ph. Eur. 2.6.14修法2026年4月发、2027年1月施，rFC为方法G，rCR未入；面板会指LAL→rFC过渡可达10年，纽约州2029禁采鲎血，中国鲎源断供促重组。
讨论与结论翻译：研究人员结论为全球脱离RPT因伦理与商业双驱动加速，欧盟EDQM删章与EMA变更程序协同，RPT仅例外临时留存且工业使用骤降，完全淘汰数年可及；MAT与RPT端点不同不宜头对头比，文献发热阈值纸面比对可免动物；MAT格式多元（PBMC/细胞系/RGA），WHO与Ph. Eur.非内毒素热原（NEPs）生物参考品助标准化；rFC于Ph. Eur. 13.1版全入，rCR待积数据；疫苗基质复杂仍挑战争；早沟通监管为必需；下一代测序污染源谱列为前瞻。综上Ph. Eur.删RPT章催化全球，非动物热原检测成下一代标准，MAT、BET、重组法按产品与辖区共存。
