《Bone》：Chicken-derived phage display antibodies against ASARM for calcification and phosphate research
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酸性丝氨酸-天冬氨酸富集基序（ASARM）是小整合素结合配体N-连接糖蛋白（SIBLING）家族共有的结构，在体内发挥多种生理功能。基质细胞外磷酸糖蛋白（MEPE）是SIBLING家族成员，其C末端保留ASARM，当组成性丝氨酸残基被磷酸化并从MEPE释放后，
酸性丝氨酸-天冬氨酸富集基序（ASARM）是小整合素结合配体N-连接糖蛋白（SIBLING）家族共有的结构，在体内发挥多种生理功能。基质细胞外磷酸糖蛋白（MEPE）是SIBLING家族成员，其C末端保留ASARM，当组成性丝氨酸残基被磷酸化并从MEPE释放后，ASARM被激活。磷酸化ASARM（pASARM）直接结合羟基磷灰石（一种钙-磷酸盐复合物），作为矿化的强效抑制剂发挥作用。pASARM通过抑制小肠和肾脏的磷酸盐吸收以及诱导成纤维细胞生长因子23（FGF23）表达，参与磷酸盐代谢的系统性调控。具有这些功能的ASARM是临床肾疾病中发生的异位钙化疾病和高磷血症的潜在治疗剂。Rowe等人报道，在慢性肾病（CKD）大鼠模型中，给予ASARM肽可同时纠正高磷血症和血管钙化，并预防钙化防御样病变。开发具有优异批次间重现性和低背景噪声的高性能抗体对于评估ASARM在临床环境中的疗效及其作为生物标志物的应用至关重要。在ASARM的基础研究中，通常使用多克隆抗体进行竞争性酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫组化染色。然而，产生具有比现有多克隆抗体更高表位特异性的单克隆抗体可以满足诊断和研究应用的严格需求。高性能单克隆抗体有望作为增强非临床和临床试验中药理学疗效评价可靠性的重要工具。此类抗体的建立可极大推进旨在阐明骨疾病和磷酸盐代谢紊乱病理生理学的研究。ASARM基序在哺乳动物物种中高度保守；因此，使用小鼠等哺乳动物的常规方法可能难以产生特异性抗体。相反，鸡在系统发育上远离哺乳动物，并且具有针对哺乳动物中保守的分子也能产生高抗体产量的优势。鸡拥有独特的抗体可变区多样化机制，称为“基因转换”，便于用单一引物对扩增所有可变区基因。因此，通过将这一系统与基因工程技术的噬菌体展示相结合，可以高效构建具有高多样性的抗体库。如果获得对ASARM表现出高反应性的单克隆抗体可变区的遗传信息，则可以轻松进行抗体的重组和修饰，从而扩大在临床和研究领域的应用范围。基于上述背景，研究人员尝试使用鸡作为免疫宿主的噬菌体展示方法，产生对ASARM具有高反应性的单克隆抗体。首先，将用抗原免疫的鸡的抗体基因构建的文库进行生物淘选，以选择ASARM特异性单链可变区片段（scFv）型抗体。随后，考虑到临床应用的免疫原性，构建了鸡-人嵌合抗ASARM IgG4（anti-ASARM IgG4），其中鸡源性可变区与人恒定区融合。通过验证载体的核苷酸序列、使用人胚胎肾293F（HEK293F）细胞进行蛋白质表达以及使用蛋白质印迹（western blotting）评估表达抗体的分子大小，确认了目标嵌合抗体的构建。最后，使用酶联免疫吸附试验（ELISA）和野生型小鼠及大鼠硬组织切片的免疫组化染色评估了所生成的抗ASARM IgG4的反应性。本研究开发的抗ASARM IgG4抗体是一种针对ASARM的新型诊断和研究工具，适用于未来的基础研究。
**论文解读：鸡源性噬菌体展示抗体靶向ASARM用于钙化和磷酸盐研究**
**1. 研究背景与问题**
酸性丝氨酸-天冬氨酸富集基序（ASARM）是小整合素结合配体N-连接糖蛋白（SIBLING）家族共有的结构域，在体内发挥多种生理功能，特别是其磷酸化形式（pASARM）通过与羟基磷灰石结合并抑制磷酸盐吸收，成为异位钙化疾病和高磷血症的潜在治疗靶点。然而，目前针对ASARM的研究主要依赖多克隆抗体，其批次间差异大、背景噪声高，难以满足临床诊断和精准药效评价的需求。由于ASARM氨基酸序列在哺乳动物中高度保守，传统哺乳动物免疫方法难以产生高特异性单克隆抗体。为此，研究人员选择进化距离较远的鸡作为免疫宿主，结合噬菌体展示技术，旨在开发具有高特异性、高重现性的抗ASARM单克隆抗体，并进一步将其改造为鸡-人嵌合IgG4形式，以降低人用免疫原性。该研究发表于《Bone》。
**2. 主要技术方法**
研究人员采用鸡作为免疫宿主，用环化人源MEPE-ASARM肽（15残基片段）免疫后，从脾脏淋巴细胞中提取总RNA，经反转录PCR扩增重链（VH）和轻链（VL）可变区基因，通过重叠延伸PCR组装为单链可变区片段（scFv），并克隆至pPDS载体构建噬菌体展示文库。经四轮生物淘选富集ASARM特异性噬菌体，从第三轮文库中筛选出高反应性单克隆。随后将阳性克隆的VH和VL基因分别插入pcSLCγ4和pcSLCκ载体，构建鸡-人嵌合抗ASARM IgG4表达载体，在HEK293F细胞中瞬时表达。通过ELISA、蛋白质印迹（western blotting）和免疫组化染色验证抗体反应性，样本来源包括8周龄雄性C57BL/6J小鼠和同龄SD大鼠的股骨组织切片。
**3. 研究结果**
**3.1 血清抗体滴度评估**
通过ELISA评估两只免疫鸡（#84和#87）的血清抗体滴度，显示前五次免疫后滴度逐步升高，第六次免疫后下降，第七次腹腔免疫后3天取脾脏。
**3.2 脾淋巴细胞来源scFv噬菌体展示文库构建**
从脾脏淋巴细胞提取总RNA，成功扩增VH（约450 bp）和VL（约350 bp）基因，组装为约850 bp的scFv片段。小规模酶切连接后，菌落PCR显示75%的克隆含有正确插入片段（1080 bp），满足文库构建要求，并建立了大规模scFv噬菌体抗体库。
**3.3 生物淘选、克隆分离与噬菌体抗体表征**
经四轮生物淘选，第三轮输出库对ASARM-BSA的反应性最高，第四轮下降。从第三轮文库中分离出56个单克隆，ELISA鉴定出5个高反应性克隆（#19、#29、#32、#39、#49），序列分析显示其中4个克隆（#19、#32、#39、#49）具有相同核苷酸序列，共获得两种独特噬菌体抗体，随后转化为IgG4形式。
**3.4 pcSLCγ4和pcSLCκ载体构建**
以克隆#29和#32的pPDS质粒为模板，成功扩增VH和VL基因，分别插入pcSLCγ4和pcSLCκ载体，测序确认无移码突变，构建了pcSLCγ4-ASARM和pcSLCκ-ASARM表达载体。
**3.5 抗ASARM IgG4的蛋白质印迹表征**
在还原条件下，抗ASARM IgG4克隆#29和#32的重链（55 kDa）和轻链（约26 kDa）大小与阳性对照鸡-人嵌合抗DNP IgG4一致。额外使用未结合BSA和ASARM-BSA的蛋白质印迹显示，抗ASARM IgG4克隆#29仅与ASARM-BSA呈浓度依赖性反应，不与BSA反应，阴性对照无反应。
**3.6 ELISA评估抗ASARM IgG4反应性**
ELISA结果表明，抗ASARM IgG4克隆#29和#32对ASARM-BSA的结合活性显著高于阴性对照（p<0.001，Dunnett检验）。
**3.7 免疫组化评估抗ASARM IgG4反应性**
使用抗ASARM IgG4对8周龄雄性C57BL/6J小鼠和同龄SD大鼠股骨进行免疫组化染色，在两种物种中均检测到骨样组织、骨细胞及周围骨基质中的ASARM阳性免疫反应；在生长板软骨中，静息区和增殖区软骨细胞也呈ASARM阳性。
**4. 讨论与结论**
研究人员成功利用鸡源性噬菌体展示技术获得两种ASARM特异性scFv型单克隆抗体，并进一步构建了鸡-人嵌合抗ASARM IgG4，通过ELISA和免疫组化验证其反应性。该嵌合抗体保留了鸡可变区的特异性，同时引入人恒定区（IgG4），可降低补体活性和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC），有望提高安全性。讨论指出，该抗体可能在肾磷酸盐重吸收、改善硬组织矿化缺陷以及缓解肾源性系统性纤维化（NSF）中具有潜在治疗价值。但研究存在局限性：未直接检测抗体结合对ASARM磷酸化状态的依赖性；未定量评估抗原-抗体结合亲和力；未在人体组织中验证免疫反应性；未在体内或体外评估抗体对磷酸盐代谢和矿化的功能影响。结论：使用鸡源性噬菌体展示方法制备了两种ASARM特异性scFv型单克隆抗体，并成功重组为鸡-人嵌合IgG4抗体，该抗体在ELISA和免疫组化中均显示对ASARM的反应性，可作为ASARM功能分析的有用工具，并具有临床应用潜力。
