《Food Chemistry: X》：Precipitation and recovery of soy protein extracted in natural deep eutectic solvents: Emphasizing solvent reusability for sustainable processing
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大豆蛋白因其良好的营养特性和功能性质，是食品配方中最重要的植物蛋白来源之一。然而，对可持续加工日益增长的兴趣促使研究人员寻找能够减少对传统溶剂依赖的环保型提取系统。在此背景下，天然低共熔溶剂（NADES）作为植物蛋白提取的有效介质受到了关注；然而，提取后的蛋白
大豆蛋白因其良好的营养特性和功能性质，是食品配方中最重要的植物蛋白来源之一。然而，对可持续加工日益增长的兴趣促使研究人员寻找能够减少对传统溶剂依赖的环保型提取系统。在此背景下，天然低共熔溶剂（NADES）作为植物蛋白提取的有效介质受到了关注；然而，提取后的蛋白质回收和溶剂再利用仍然面临重大的实际挑战。在本研究中，研究人员通过等电点沉淀、使用水、乙醇或水:乙醇（1:1）在提取液:抗溶剂比例（1:2至1:6）下的抗溶剂沉淀，以及一种涉及等电点（pI）调节后加水:乙醇的顺序组合策略，从使用氯化胆碱:甘油NADES脱脂豆粕中回收提取的大豆蛋白。抗溶剂的类型和稀释比例都对沉淀行为有显著影响。水在低稀释比例下未产生可见沉淀，而含乙醇的系统则更有效地促进了蛋白质聚集。在所有方法中，组合的pI + 水:乙醇（1:4）方法给出了最有利的结果，产生了6.03%的沉淀产率、77.47%的蛋白质回收率和最高的蛋白质纯度（88.60%）。衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR–FTIR）分析表明，回收后主要的蛋白质谱带（酰胺I–III）得以保留，而扫描电子显微镜（SEM）图像则揭示了蛋白质典型的、不规则的聚集颗粒形态。在溶剂再利用方面，NADES回收率在三个连续循环中保持较高水平（96.4%至89.6%），而提取效率保持率则逐渐下降。这种下降伴随着粘度从63.2 mPa·s增加到88.8 mPa·s，尽管在回收溶剂的FTIR光谱中未观察到主要的结构变化。这些发现表明，将电荷中和与极性调节相结合是从NADES中回收高纯度大豆蛋白的有效策略，并支持在闭环提取系统中短期内重复使用NADES。
**研究背景与目的**
大豆蛋白因其均衡的氨基酸组成和良好的功能特性（如乳化性、凝胶性），是食品工业中最重要的植物蛋白来源之一。传统的碱性提取-酸沉淀法虽然有效，但存在水耗大、能耗高、废水排放多以及可能引起蛋白质变性等问题，与绿色化学和循环生物经济的理念存在冲突。近年来，天然低共熔溶剂（NADES）因其低挥发性、可生物降解、可调节的理化性质以及能够破坏细胞壁并促进生物大分子溶解的特性，被视为一种极具前景的绿色提取介质，特别是氯化胆碱:甘油体系因其低毒性和生物相容性而备受关注。
然而，尽管NADES在植物蛋白提取方面展现出高效性，其工业化应用的关键瓶颈在于下游的蛋白质回收和溶剂的循环利用。NADES基质通常具有高粘度、非挥发性，这使得传统的沉淀、相分离和溶剂去除过程变得复杂。现有的研究多采用单一沉淀策略（如等电点沉淀、抗溶剂沉淀），但往往缺乏对蛋白质纯度、结构完整性以及后续溶剂可重复使用性的系统评估。特别是，在稀释密集型沉淀步骤后，溶剂的定量回收和性能基准数据仍然有限。因此，本研究的核心目标是开发并系统评估一种从氯化胆碱:甘油NADES中回收大豆蛋白的沉淀策略，并着重分析溶剂的回收与多循环再利用性能。
**主要关键技术方法**
1. **NADES制备与提取：** 采用摩尔比为1:2的氯化胆碱/甘油，在80℃下搅拌形成均质液体，并加入水（30% v/v）以降低粘度。
2. **蛋白质沉淀策略：** 系统比较了三种沉淀方法：(i) 等电点（pI，pH 4.5）沉淀；(ii) 使用水（W）、乙醇（E）或水:乙醇混合物（WE, 1:1 v/v）作为抗溶剂，在不同提取液/抗溶剂比例（1:2, 1:4, 1:6）下进行抗溶剂沉淀；(iii) 先调节pI再进行抗溶剂沉淀的顺序组合策略（pI + WE）。
3. **蛋白质表征：** 使用Bradford法测定蛋白质含量，Dumas燃烧法测定总氮以计算蛋白质纯度，衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）分析蛋白质二级结构，扫描电子显微镜（SEM）观察颗粒形态。
4. **溶剂回收与再利用性评估：** 通过离心分离沉淀后的NADES相，经旋转蒸发和真空干燥去除水分和乙醇（样品来源：土耳其Adana的Sunar M?s?r公司提供的脱脂豆粕）。
**研究结果**
**3.1. 来自氯化胆碱:甘油提取液的蛋白质沉淀性能**
- **通过单一沉淀方法比较发现：** 当使用水:乙醇混合物（WE）作为抗溶剂且比例为1:6时，获得了最高的沉淀产率（5.801%）。等电点（pI）沉淀法获得了最高的回收率（76.79%），但沉淀产率并非最高，说明仅靠电荷中和不足以完全破坏NADES-蛋白质的相互作用。水作为抗溶剂在低稀释比例下（1:2和1:4）完全无效，仅在1:6高稀释比下才产生沉淀，表明水需要大量稀释才能破坏NADES的溶剂化环境。
- **通过组合方法（pI + WE）的研究发现：** 首先进行电荷中和（调节pI至4.5），随后降低介质介电常数（加入WE混合物），实现了显著的协同效应。沉淀产率提升至6.032%，回收率提高至77.47%，显著优于任何单一方法。
- **结论：** 极性调节和静电去稳定化的组合策略是最大化蛋白质从ChCl:Gly基NADES中回收的关键决定因素。
**3.2. 沉淀蛋白质的纯度分析**
- **通过蛋白质纯度测定发现：** 不同沉淀策略所得蛋白质纯度差异显著（p<0.05）。组合方法（pI + WE (1:4)）获得了最高的纯度（88.6%），其次是pI方法（83.9%）、WE 1:4（79.8%）、E 1:4（73.6%）和W 1:6（68.4%）。
- **结论：** 水作为抗溶剂导致纯度最低，因其高极性环境可能促进亲水性非蛋白化合物和NADES组分的共沉淀。乙醇体系提高了纯度，但等电点沉淀显示出更高的选择性。组合方法通过先极性调节（削弱NADES-蛋白质氢键），再进行电荷中和（促进选择性聚集），实现了产率和高纯度的最佳平衡，体现了在产量和选择性之间的权衡优化。
**3.3. 蛋白质的傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析**
- **通过FTIR光谱分析发现：** 所有回收的大豆蛋白粉末的FTIR光谱高度相似，均显示出蛋白质的特征酰胺I（~1650-1630 cm
-1，C=O伸缩）、酰胺II（~1545-1530 cm
-1，N-H弯曲与C-N拉伸耦合）和酰胺III（~1240-1300 cm
-1）谱带。未观察到主要谱带的消失或新谱带的出现，表明沉淀过程并未导致蛋白质骨架的主要化学改变。
- **结论：** 不同沉淀方法引起的谱带宽度和相对强度的微小差异，可能反映了氢键、水合状态和蛋白质-溶剂相互作用的不同，而非蛋白质结构的化学变化。FTIR结果支持了沉淀策略未对回收蛋白质造成严重化学损伤的结论。
**3.4. 回收蛋白质的形态学分析**
- **通过扫描电子显微镜（SEM）观察发现：** 所有回收的蛋白质粉末均呈现出不规则、碎片化和聚集的形态，这是干燥植物蛋白分离物的常见特征。水沉淀样品结构相对松散，而乙醇沉淀样品则显示出更致密、聚集的形态。组合方法处理的样品形态与pI方法相似。
- **结论：** SEM图像提供了定性支持，表明不同的沉淀环境影响了聚集体的物理排列，但所有样品均处于典型的植物蛋白粉末形态范围内。
**3.5. NADES的重复使用性和提取性能**
- **通过溶剂回收和再利用实验发现：** 在三个连续循环中，NADES的质量回收率虽高（从96.4%降至89.6%），但提取效率保持率逐渐下降（从100%降至86.3%）。伴随下降的是回收NADES的粘度显著增加（从63.2 mPa·s升至88.8 mPa·s），折射率轻微上升，pH值略微下降（从6.08降至5.92）。
- **通过FTIR光谱分析发现：** 回收的NADES（DES1至DES3）的FTIR光谱保持高度一致，表明氯化胆碱:甘油的氢键结构在重复使用过程中基本得以保留。
- **结论：** 尽管溶剂回收率高，但粘度累积是导致提取效率下降的主要原因，因为它阻碍了传质。虽然结构稳定，但长期循环使用需要控制溶剂粘度以维持性能。
**总结与讨论部分：结论**
本研究清晰地表明，沉淀路径在很大程度上决定了从氯化胆碱:甘油NADES提取液中回收大豆蛋白的效果。单一方法存在选择性限制：等电点沉淀最大化回收率，而含乙醇的抗溶剂比水更有效地促进相分离，水在低稀释度下无效。组合策略（pI + WE）实现了最佳平衡，在测试条件下达到约77%的回收率和约89%的纯度，并获得了最高的沉淀产率。FTIR显示蛋白质主链谱带无显著变化，SEM揭示了大致相似的干燥粉末形态，但存在一些路径依赖的差异。重要的是，NADES能通过三个循环被回收并重复使用，具有高质量回收率（~90%）和可接受的提取能力保持率（>85%），其主要限制是可能限制传质的粘度累积。这些发现为在基于NADES的植物蛋白加工中整合蛋白质回收和溶剂再利用提供了实践基础，同时强调了在延长循环使用中对粘度/组成进行控制的必要性。尽管回收的蛋白质保留了其主要结构特征，但对其功能特性（如溶解度、乳化活性和起泡能力）的进一步研究，将为它们在食品和工业配方中的潜在应用提供宝贵见解。该论文发表在《Food Chemistry: X》。
