评估食品基质对检测E型肉毒杆菌神经毒素的夹心ELISA方法的影响

《Food Bioscience》：Evaluation of food matrix effects on a sandwich ELISA for detecting botulinum neurotoxin type E.

　　摘要：E型肉毒杆菌神经毒素是一种毒性极强的食源性毒素，因此需要快速、灵敏且可靠的检测方法来有效开展食品安全监测。本研究采用夹心ELISA技术，以兔多克隆抗rBoNT/E IgG作为捕获抗体，鼠多克隆抗rBoNT/E IgG作为检测抗体。在该检测缓冲液中，该方法的最低检测限为0.24纳克/毫升。进一步在多种代表性食品基质中评估了其分析性能，结果显示鸡肉、鱼类、玉米和番茄酱的最低检测限为0.97纳克/毫升，猪肉、香肠和虾的最低检测限为3.90纳克/毫升，而奶酪的最低检测限则为15.62纳克/毫升，这表明检测灵敏度会因基质不同而有所差异。加标回收实验显示，该方法的分析准确性良好，回收率在86.10%至124.37%之间。此外，该方法的重复性和再现性也表现优异，试验内变异系数和试验间变异系数分别低于8%和7%。而且，与其他BoNT血清型的重组重链结合域或轻链蛋白不存在交叉反应，进一步证明了所开发免疫测定的高特异性。综上所述，这种夹心ELISA方法是一种灵敏、特异且可靠的检测工具，适用于复杂食品基质中E型肉毒杆菌神经毒素的检测，在常规食品安全监测与预警工作中具有广泛应用潜力。

引言：肉毒杆菌神经毒素是一类重要的神经麻痹性蛋白质，主要由肉毒梭菌产生，偶尔也会由丁酸梭菌和巴雷特梭菌产生（Rawson等人，2023年）。这类毒素会导致肉毒中毒，这是一种严重且可能危及生命的疾病，其特征为肌无力以及较高的发病率。由于其极高的毒性、严重的临床后果以及可能的滥用风险，美国疾病控制与预防中心将肉毒杆菌神经毒素列为A类生物威胁物质（Cenciarelli等人，2019年）。在七种血清学上不同的肉毒杆菌神经毒素血清型中，E型与食源性疾病性肉毒中毒关系尤为密切，尤其是在鱼类和海产品占饮食主要成分的地区（Uzal等人，2024年）。E型肉毒杆菌神经毒素主要与II群肉毒梭菌中的非蛋白水解型、致幻型菌株相关（Grenda等人，2023年）。来自北欧、北美、日本以及北极地区的多项流行病学调查表明，与熏鱼、发酵鱼、贝类以及其他轻度加工的水产品相关的疫情中，常常存在E型肉毒杆菌神经毒素的身影（Walton等人，2014年）。

E型肉毒杆菌神经毒素的毒性作用是通过受体介导的神经元摄取实现的，随后SNARE蛋白被切割，从而导致乙酰胆碱释放受阻，进而引发肌无力（Monash等人，2025年）。与A型或B型肉毒杆菌神经毒素相比，E型引起的临床症状出现得更为迅速，有时在摄入后数小时内就会显现（J. Wang等人，2022年）。这种快速的发病特点凸显出在疑似受污染的食品样本中及时、准确检测E型肉毒杆菌神经毒素的重要性，只有这样才能有效开展公共卫生应对工作，控制疫情蔓延。

历史上，由于具有较高的灵敏度以及能够检测具有生物活性的毒素，小鼠生物测定法一直被用作检测肉毒杆菌神经毒素的参考方法（Lindstr?m & Korkeala，2006年）。然而，出于伦理考虑、检测耗时较长、处理量低，以及需要专门的动物实验设施，该方法并不适合用于常规的食品检测。因此，人们越来越重视开发快速、灵敏、特异、可大规模应用且符合伦理要求的替代诊断方法。在这些替代方法中，基于免疫测定的方法，尤其是ELISA技术，因其操作简单、适应性强以及具备高通量筛选的潜力，而被视为极具前景的工具（Ferreira等人，2004年；Sharma等人，2006年；Singh等人，2015年）。ELISA是一种高度特异且用途广泛的免疫测定方法，它已被广泛应用于免疫学、炎症研究、肿瘤学以及临床诊断领域，通过使用抗原特异性抗体以及基于已知标准品建立的校准曲线，可实现对细胞因子及其他蛋白质生物标志物的定量检测。其出色的分析灵敏度、特异性以及适应性，使其成为各种生物学和食品相关领域中用于蛋白质定量分析的最常用技术之一（Jurisic，2020年）。除了免疫学方法之外，还有多种体外检测方法被用于检测肉毒杆菌神经毒素。有一些基于细胞的检测方法，通过检测乳酸脱氢酶等细胞内酶的释放情况来评估毒素引发的细胞毒性，这类方法被视为减少对动物实验依赖的灵敏检测替代方案（Jurisic，2003年；Jurisic等人，2015年）。尽管这些方法能够提供有关毒素活性的重要信息，但它们通常需要细胞培养设施、较长的检测时间以及专业的技术知识，这就限制了它们在快速、常规的食品检测中的应用。

虽然已经有多种分析平台被用于检测肉毒杆菌神经毒素，但每种方法在灵敏度、操作复杂性、成本以及可扩展性方面都存在一定的权衡。诸如基于内肽酶的方法并结合质谱检测的功能性检测方法，由于能够直接检测毒素活性，具有极高的灵敏度，甚至可以达到亚纳克级的检测限（Kalb等人，2006年、2015年）。然而，这类方法依赖于复杂的仪器设备、受过专业培训的人员以及繁琐的样品前处理流程，这就限制了它们在资源有限的地区进行大规模食品监测时的应用（Lindstr?m & Korkeala，2006年）。而基于PCR的分子检测方法虽然能够快速检测出产毒微生物，但却无法直接确认受污染食品样本中是否存在具有生物活性的毒素（Fach等人，2009年；Lindstr?m & Korkeala，2006年）。相反，传统的免疫测定方法虽然在操作简便性、成本以及检测通量方面具有优势，但其灵敏度通常较低，而且还可能受到食品基质因素的干扰（Sharma等人，2006年；Stanker & Hnasko，2015年）。在包括印度在内的多个地区，市面上可供使用的专门针对E型肉毒杆菌神经毒素的检测试剂盒仍然十分有限，这就需要开发出兼具足够灵敏度与实际应用可行性的实验室自制检测方法。因此，基于多克隆抗体的夹心ELISA方法是一种极具前景的策略，它可以通过多重表位识别、与常规实验室基础设施的兼容性、较高的成本效益，以及具备大规模应用的潜力，为常规食品安全监测提供有力支持。

夹心ELISA格式通过同时识别不同的抗原表位，提高了检测的特异性，降低了交叉反应的发生概率（Stanker & Hnasko，2015年）。然而，在食品基质中应用基于ELISA的方法检测E型肉毒杆菌神经毒素时，往往会受到基质效应的极大影响。与纯化的缓冲液体系不同，食品基质本身具有复杂的组成，其中含有多种化学成分和生物成分，这些成分都可能干扰免疫化学反应的进行（Jangid等人，2025年）。基质效应会通过降低毒素提取效率、促进非特异性相互作用、改变毒素的稳定性或表位的可及性，以及由于基质成分、pH值、离子强度、粘度以及光学特性的差异而干扰信号生成等方式，显著影响毒素的检测结果（L. Wang等人，2024年）。鉴于E型肉毒杆菌神经毒素与多种成分和加工工艺各不相同的食品存在关联，这些由基质引起的检测难题尤为重要。系统地评估基质效应对于确保免疫测定方法在真实食品检测环境中的可靠性至关重要。通过评估回收效率、针对特定基质的最低检测限、稀释线性度、潜在的干扰因素以及与基质特性相匹配的校准要求，可以明确复杂样品条件下的方法性能。如此严格的验证工作能够最大限度地降低出现假阴性结果或不可靠检测结果的风险，也有助于将夹心ELISA方法作为一种可靠的工具，用于E型肉毒杆菌神经毒素的检测以及食品安全监测工作。

近年来，可持续分析技术以及食品监测体系的不断发展，凸显出了快速、高效且易于获取的诊断方法在加强食品安全监测、保障农业和食品系统的稳定运行方面的日益重要性（Jin & Xu，2025a，2025d年）。食源性疾病污染事件不仅会给公众健康带来严重威胁，还会通过食品召回、贸易中断、消费者信心下降以及食品供应链不稳定等因素，造成巨大的社会经济损失。因此，快速且可靠的检测系统越来越被视为提升食品质量监测水平、实现资源高效利用以及加强食品系统管理的重要工具。新兴的技术和分析方法进一步凸显了创新检测平台在推动现代农业和食品产业向可持续发展、循环经济模式以及公平的资源管理方向转型方面的关键作用（Jin & Xu，2025c，2025b年）。在此背景下，开发可用于快速检测E型肉毒杆菌神经毒素的实用免疫诊断方法，是提升食品安全防范能力、推动可持续食品监测战略发展的重要举措。

本研究正是为了解决这一迫切需求而开展的，旨在评估基于夹心ELISA方法的E型肉毒杆菌神经毒素检测中所存在的基质效应问题。研究重点选择了在污染事件中较为常见，或者被纳入常规毒素监测项目的代表性食品基质，即肉类基质和植物性基质。通过全面评估回收率、检测限、信号抑制或增强情况以及整个检测方法的稳健性，本研究旨在明确基质成分对检测方法性能的影响程度。通过注重对基质因素的系统性分析，本研究有助于提升用于检测E型肉毒杆菌神经毒素的免疫化学方法的科学严谨性及其实际应用价值。在面对成分复杂多样的食品基质时，仍能保持稳定分析性能的可靠检测系统，对于有效的食品安全监测、疫情应对以及公共卫生防范工作而言至关重要。在当今食品产品全球分布范围不断扩大、人们对轻度加工食品的消费日益增加的背景下，开发能够适配不同食品基质的检测平台显得尤为重要。因此，一种经过验证、能够耐受不同基质影响的E型肉毒杆菌神经毒素检测用夹心ELISA方法，无疑是对食源性疾病毒素监测以及保障消费者安全工作的重要贡献。

试剂与材料：F8 Maxisorp Loose nunc-immuno Module（Nunc公司，产品编号127747）；氯化钠（Merck公司，产品编号7647 - 14 - 5）；磷酸二氢钠（Sigma - Aldrich公司，产品编号6.18558）；氯化钾（Merck公司，产品编号17792）；磷酸二氢钾（Merck公司，产品编号7778 - 77 - 0）；吐温 - 20（Sigma公司，产品编号P1379）；碳酸氢钠（Sigma公司，产品编号S4019 - 500G）；碳酸钠（Sigma公司，产品编号71345）；SM Powder（HiMedia公司，产品编号GRM1254 - 500G）；山羊抗鼠HRP偶联IgG抗体（Sigma公司，产品编号12–349）；3, 3′,5,5′-四甲基联苯胺液体底物（Sigma公司，产品编号T4444）。

在检测缓冲液中检测rBoNT/E：首先使用在检测缓冲液中制备的rBoNT/E抗原来评估该夹心ELISA方法的检测性能。该检测方法能使吸光度信号随浓度增加而上升，从而能够在大约0.25 – 250纳克/毫升的确定工作范围内可靠地检测出rBoNT/E（见图1）。在这个范围内，检测信号足以用于定量分析。该夹心ELISA方法的最低检测限是通过空白对照法确定的，其计算方式如下……

讨论：在食品安全监测工作中，可靠地检测食品基质中的E型肉毒杆菌神经毒素，仍是目前尚未得到满足的关键需求，这一工作旨在预防食源性疾病性肉毒中毒疫情的爆发。本研究介绍了用于检测rBoNT/E的夹心ELISA方法的开发过程，以及在该检测缓冲液以及多种复杂食品基质中的综合性能评估情况。该检测方法在缓冲液条件下表现出优异的分析性能，对于rBoNT/E的最低检测限为0.24纳克/毫升，且具有较高的准确度和精密度。

结论：本研究成功开发出一种用于检测rBoNT/E的灵敏且稳健的夹心ELISA方法，并在多种食品基质中对该方法进行了分析验证。通过使用一对多克隆抗体，该检测方法在检测缓冲液条件下的最低检测限为0.24纳克/毫升，并且在常见的肉类、乳制品、植物性食品以及加工食品基质中均保持了稳定的分析性能，不过不同基质下的最低检测限在0.97纳克/毫升到15.62纳克/毫升之间不等。该检测方法展现出了稳定的分析性能……

CRediT作者贡献说明：Ponmariappan Sarkaraisamy：撰写——审阅与编辑、指导、资源提供、概念构思。Jyotsna Dhubkarya：撰写——初稿撰写、方法设计、实验实施、正式分析、概念构思。

资金来源说明：这项研究得到了印度国防研究与发展组织（DRDO）的资助。Jyotsna Dhubkarya还获得了DRDO提供的研究奖学金。

利益冲突声明：? 作者声明他们不存在任何已知的、可能会影响本文研究结果的财务利益或个人关系。

致谢：作者们要感谢印度中央邦瓜廖尔市詹西路处的国防研究与发展组织（DRDO）的负责人，感谢他在整个研究过程中给予的鼓励和坚定的支持。同时，作者们也感谢DRDO为研究提供了必要的设施和仪器设备。这篇论文已被赋予DRDE编号DRDE-IREC-315–04022026。

Jyotsna Dhubkarya | Ponmariappan Sarkaraisamy
印度中央邦瓜廖尔市詹西路，国防研究与发展组织（DRDE），生物检测器研发测试与评估部门，邮编474002