基因组测序显示，htpX是食源性病原体维罗尼阿埃罗蒙斯菌的一种新型腐败因子：有助于了解其胞外酶、生物膜形成、耐逆性、毒力及腐败机制

《Food Microbiology》：Genomic sequencing reveals htpX is a novel spoilage factor from foodborne pathogen Aeromonas veronii: Insights into extracellular enzymes, biofilm formation, stress tolerance, virulence and spoilage

　　

摘要

腐败细菌Aeromonas veronii对可食用双壳类水产品的安全构成日益严重的威胁，但其主要致腐因子的调控机制至今仍不甚明了。本研究中，从可食用的Hyriopsis cumingii中分离出食源性病原菌A. veronii GL2，并对其进行了基因组测序，发现热处理过程中编码金属蛋白酶的htpX基因的mRNA水平显著上升。随后构建了htpX缺陷突变体（ΔhtpX），以研究该基因在致病性及致腐能力中的作用。尽管htpX缺失并未影响细菌的生长或蛋白水解活性，但却显著降低了其生物膜形成能力、溶血活性以及应对环境压力的能力。在H. cumingii的血淋巴模型中，ΔhtpX在上清液中的存活率更低，对血细胞的毒性也有所降低。进一步的研究表明，ΔhtpX的LD₅₀值比GL2高18.5倍，且可食用部位（足部、内收肌）中的细菌负荷也有所减少。此外，ΔhtpX的致腐能力也明显减弱，细菌增殖的降低进一步导致了TCA可溶性肽、TVB-N含量以及pH值的下降。综上所述，这些研究结果表明htpX是连接蛋白质质量控制与A. veronii致腐及致病性的新关键因子，为制定防控水产品中A. veronii污染的策略提供了新的靶点。

引言

可食用软体动物对生态环境和人类社会都具有极高的价值。它们既是环境生物指示物，也能为人类提供食物、珍珠以及书写用墨水（Lewbart和Zachariah，2023）。尤其值得一提的是，可食用软体动物还是人类营养中多不饱和脂肪酸（PUFAs）的重要来源（Karthick Rajan等人，2024），因此具有很高的商业价值。尽管它们具有重要的经济价值，但常见的腐败微生物却严重威胁着新鲜（或活体）可食用软体动物的运输安全，甚至导致食品变质。细菌通常被认为是微生物导致食品腐败的主要因素，腐败过程会伴随难闻气味的产生以及肉质变得异常松软（Shao等人，2023）。近年来，这种威胁在双壳类水产品中尤为突出，大多数腐败事件都是由Vibrio属、Pseudoalteromonas属和Shewanella属细菌引起的（Xie等人，2024）。不幸的是，Aeromonas属细菌也被认为兼具致病性和致腐性两种功能（Palamae等人，2025）。有研究指出，这一新兴的细菌属在可食用双壳类水产品的腐败过程中起着关键作用，包括海洋蛤类（Paphia undulata、Meretrix meretrix）乃至淡水贝类（Hussain等人，2014）。因此，迫切需要采取有效措施来保障受Aeromonas属细菌污染的水产品安全。

Aeromonas veronii是一种革兰氏阴性菌，属于在水产品中广泛存在的高致病性腐败细菌，会对公众健康构成威胁。遗憾的是，全球消费市场中A. veronii污染事件不断增加。这与其广泛的分布密切相关，例如在埃及农场采样的Mugil seheli鱼中，该菌的检出率为22.5%（Algammal等人，2022）；甚至在英国零售食品样本中也有该菌的存在（Harding-Crooks等人，2025）。在6个水产养殖基地的357份贝类样本中分离出了47株A. veronii，这些菌株携带多种致病因子（fla、alt、act基因）以及抗生素耐药基因（strA的检出率为95.7%，strB的检出率为93.6%）（Xu等人，2021），这进一步凸显了A. veronii的致腐潜力。不过，以往的研究大多集中在A. veronii的遗传特征上，其在腐败过程中的致病因子调控机制仍未得到充分研究。CadA-CadB操纵子负责调控尸胺的产生与分泌，而尸胺被视为一种腐败指标物（Soksawatmaekhin等人，2004）。然而，cadA基因缺失仅会降低A. veronii的游动能力，却意外地促进了其生物膜的形成（Li等人，2021）。这一反常现象似乎表明，A. veronii的关键致腐因子可能并非那么容易识别。此外，目前已有多种控制策略被广泛应用，比如植物提取物、益生菌以及抗菌肽等（Dong等人，2022）。特别是在控制A. veronii的腐败方面，从Bacillus subtilis中提取的粗脂肽能够有效抑制其腐败表现，包括生物膜的形成（Y. Li等人，2024）。不过，这些控制策略针对A. veronii的具体分子靶点仍然不明确，因此有必要进一步研究这种食源性菌株的关键致腐因子。

腐败细菌在运输过程中很容易受到冷链条件或氧化应激等不良环境因素的影响，从而导致蛋白质错误折叠并异常积累（Dong等人，2021）。因此，维持细胞内的稳态对于腐败细菌的生存至关重要。多项研究表明，膜上的蛋白质质量控制系统为维持细胞稳态提供了重要支持（Godlewska等人，2025；Marciniak等人，2012）。其中，HtpX属于M48蛋白酶家族，是一种膜结合型金属蛋白酶，其活性受细胞质外的应激相关因子Cpx调控（Akiyama，2009）。由于HtpX最初是在Escherichia coli中被确定为热休克调控基因（Kornitzer等人，1991），此后关于它对外界威胁响应的研究也逐渐增多。在足够量的锌离子存在下，HtpX具有切割SecY蛋白的活性（Sakoh等人，2005）；最近的研究还证实，SecY蛋白的稳态与蛋白质转运以及腐败过程中的氨生成有关（Yang等人，2026）。此外，在革兰氏阳性细菌中也发现了类似的蛋白质质量控制系统。作为HtpX的相似基因，B. subtilis中的YkrL在其工业相关蛋白过量表达时也能发挥类似的“抑制作用”（Marciniak等人，2012）。值得注意的是，抗生素也会促使错误折叠的蛋白质积累。最新研究显示，HtpX参与了Stenotrophomonas maltophilia、Neisseria gonorrhoeae以及Pseudomonas aeruginosa的抗生素耐药性，这表明它有可能成为新的控制策略靶点（Huang等人，2018；Vashishtha等人，2023）。不过，目前针对HtpX在细菌腐败过程中作用的研究仍然相对有限。

Hyriopsis cumingii是一种用途广泛的淡水双壳类水产品，为食品工业和医药领域做出了重要贡献。尤其是其肉中所含的多糖具有缓解炎症疼痛的作用（Hu等人，2026），还被证实可作为挤压面制品的防腐剂（Ke等人，2021）。然而，频繁发生的疾病严重阻碍了食品产业的健康发展（Coates和S?derh?ll，2021）。需要指出的是，Aeromonas菌长期以来一直被认为是影响H. cumingii养殖业的主要病原菌（Zhong等人，2016）。在本研究中，我们从这种贻贝的肉中分离出一种食源性A. veronii菌株并对其进行基因组测序，随后通过同源重组技术构建了ΔhtpX突变体。接着，我们研究了该突变体在可食用H. cumingii中的致腐能力及致病性变化。最后，我们还检测了可食用组织中的腐败相关理化指标以及体内细菌负荷，以此评估htpX基因的致腐作用。这些研究结果可为后续探索腐败机制提供重要依据，也为预防A. veronii引发的腐败和致病问题提供理论支持。

章节节选

菌株、质粒及实验动物

本研究所需的菌株和质粒信息如下：野生型A. veronii GL2菌株具有氨苄西林抗性，是从可食用H. cumingii的肉中分离出来的，之后被保存在-80℃条件下。感受态细胞WM3064以及质粒pRE112和pBBR1MCS是由Kang博士提供的，早先就被保存在我们的实验室中。

健康的H. cumingii个体（湿重为24.16±2.55克）是从中国浙江省的一家养殖场购买的，随后被置于为期两周的

基因组测序及关键致腐因子htpX的筛选

圆形基因组图谱（图1A）显示，A. veronii GL2的基因组由4729012个碱基对组成，共预测出4291个编码DNA序列（CDSs，也可视为基因）。此外，还分别利用GO数据库（图1B）和KEGG数据库（图1C）对1914个和3295个基因进行了功能注释。GO分类结果显示，与分子功能相关的基因数量最多，占所有预测CDSs的35.7%。在KEGG通路分析中，

讨论

由于其日益增长的经济价值，可食用双壳类水产品如今在水产养殖领域占据重要地位（Zannella等人，2017）。其中，H. cumingii在中国的水产养殖产业中占据核心地位，为中国国内淡水珍珠的总产量贡献了80%以上（Huo等人，2022）。此外，H. cumingii的可食用部位（足部、内收肌）不仅能满足消费者需求，其富含的多糖还具有营养和药用价值（Qiao等人，2010）。不过，近期

结论

综上所述，通过基因组测序结合热应力诱导的转录组分析，我们成功确定了膜结合型金属蛋白酶编码基因htpX是A. veronii的一种新型致腐因子。进一步的分析表明，htpX与生物膜形成、溶血活性、氧化应激耐受性以及致病性都存在关联。ΔhtpX突变体在可食用部位中的致腐能力显著减弱，同时TCA可溶性肽、TVB-N含量以及pH值也出现了相应变化

伦理声明

本研究已获得西南大学机构伦理委员会的审批通过（批准编号为SWU_LAC2024110307）。

CRediT作者贡献说明

Xiaoqi Tang：正式分析、方法学、软件应用、数据可视化、初稿撰写。Guihong He：方法学、论文修改与润色。Desheng Wang：方法学、论文修改与润色。Xiaobo Yu：资源准备、论文修改与润色。Yanhong Li：资源准备、论文修改与润色。Zhengli Wu：概念设计、项目管理、论文修改与润色。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

我们的研究部分得到了西南大学食品科学学院的徐周博士的支持。同时，我们也感谢山东大学（威海）的袁欢欢副教授提供了质粒以及Escherichia coli WM3064菌株。此外，本研究还获得了中国重庆市研究生科学研究创新基金（项目编号CYB240139）、重庆市现代农业产业技术体系（项目编号CQMAITS202315）以及重庆市自然科学基金的支持。

Xiaoqi Tang|Guihong He|Desheng Wang|Xiaobo Yu|Yanhong Li|Zhengli Wu

中国重庆400715，西南大学，渔业学院，淡水鱼类繁殖与发育重点实验室（教育部），长江上游水生生物多样性保护研究中心