通过计算方法筛选出组织蛋白酶B和L的抑制剂，及其在调节未清洗草鱼（Ctenopharyngodon idella）肉糜的蛋白质降解与凝胶化过程中的作用

《Food Chemistry》：Computational identification of cathepsin B and L inhibitors and their role in modulating protein degradation and gelation of unwashed grass carp ( Ctenopharyngodon idella) mince

　　

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  分子建模技术用于揭示组织蛋白酶的结构与表面特征。
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  通过分子对接实验，确定柚皮素、阿魏酸、原花青素和木犀草素具有抑制作用。
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  这些天然抑制剂能够抑制组织蛋白酶的活性，进而减少蛋白质降解。
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  原花青素可通过形成交联结构来保持蛋白质的完整性，降低其降解程度。
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  这类抑制剂还能改善未清洗鱼糜的流变性能、质地以及保水能力。

引言

鱼糜是一种从鱼肌中提取的浓缩肌原纤维蛋白，因其良好的凝胶化、弹性和保水性能，成为各类凝胶型海产品的主要原料（Niu, Yu, Xue, Xue, & Mao, 2024; Zhao et al., 2024）。传统的鱼糜加工需要经过多次洗涤，以去除肌浆蛋白、脂质、血液以及其他可能影响凝胶形成和产品质量的水溶性杂质（Wu et al., 2024）。虽然这种处理方式能提升凝胶的质地和外观，但反复洗涤会导致大量水资源消耗、营养成分流失、生产成本上升以及环境问题（de Albuquerque Sousa, Ferreira, da Silva Araújo, & da Silva, 2022; Jiao et al., 2019）。

为解决这些问题，直接使用未清洗鱼糜的加工方式逐渐被视为一种更可持续且更能保留营养的替代方案（Priyadarshini, Xavier, Nayak, Dhanapal, & Balange, 2017; Somjid, Panpipat, Cheong, & Chaijan, 2021）。由于减少了洗涤次数，未清洗鱼糜能保留更多内在营养成分，同时简化加工流程。然而，其中的脂质、肌浆蛋白和蛋白酶等残留物质仍可能对凝胶形成及最终产品品质产生不良影响。其中，被称为组织蛋白酶的内源半胱氨酸蛋白酶由于其广泛的底物特异性和热稳定性，危害尤为严重（Chéret, Delbarre-Ladrat, Lamballerie-Anton, & Verrez-Bagnis, 2007; Kwon & Chang, 2021）。这类参与细胞内蛋白质代谢及鱼体死后软化的酶，在热凝胶化过程中可能保持活性或重新激活（Chéret et al., 2007; Li, Xie, & Chu, 2023）。一旦被激活，如组织蛋白酶B和L这类酶就会分解关键的肌原纤维蛋白，从而削弱凝胶网络结构，降低凝胶强度、保水能力以及整体产品稳定性（Kwon & Chang, 2021）。

近年来，多酚类和黄酮类等天然化合物因具备抑制内源蛋白酶、保持肌原纤维蛋白完整性以及提升凝胶品质的潜力而受到关注（Guo et al., 2024; Han & Li, 2024）。这些化合物可通过直接与蛋白酶活性位点结合或改变蛋白质构象，从而阻碍酶的作用。但由于天然化合物结构多样且复杂，通过传统实验筛选有效抑制剂效率低下且耗时费力。分子建模和分子对接等计算方法则为预测酶与配体的相互作用、识别关键结合位点以及从分子层面阐明天然化合物的潜在抑制机制提供了有效途径。此外，分析目标酶的理化性质和结构特征，如活性位点、催化残基以及表面疏水性，也有助于了解其催化机制及与抑制剂的相互作用情况。

在本研究中，我们探讨了多种天然化合物在未清洗鱼糜凝胶体系中抑制组织蛋白酶活性的潜力。首先通过分子建模分析组织蛋白酶的结构与表面特性，再通过分子对接筛选出可能的天然抑制剂。随后系统评估了这些化合物对组织蛋白酶活性、肌原纤维降解、凝胶流变性能、质地、保水能力以及凝胶微观结构的影响。本研究旨在深入理解组织蛋白酶介导的蛋白水解作用在未清洗鱼糜凝胶不稳定现象中的作用机制，同时为利用天然化合物提升凝胶品质和产品稳定性提供理论依据。

章节要点

计算机模拟分析组织蛋白酶的结构与表面特性

草鱼组织蛋白酶B和L的氨基酸序列取自UniProt数据库（组织蛋白酶B：UniProt ID A0A498MHB7；组织蛋白酶L：UniProt ID A0A0D5MDN3）。通过InterProScan和SMART工具分析了它们的结构域组成。利用DiANNA服务器预测了可能的二硫键形成情况。通过POLYVIEW软件计算并标注了各氨基酸残基的相对溶剂可及性及理化性质。还分析了其表面疏水性分布情况

计算机模拟分析草鱼组织蛋白酶的结构与表面特性

本研究采用了生物信息学方法对草鱼组织蛋白酶B和L进行了分析，包括结构域分析、二硫键预测以及三维结构建模与评估，为后续抑制剂筛选和机制研究提供支持。预测结果显示，组织蛋白酶B和L的分子量分别约为39.6?kDa和38.5?kDa。它们的不稳定性指数分别为27.3和33.0，均低于40，表明其整体结构较为稳定

结论

分子建模和分子对接实验表明，柚皮素、阿魏酸、原花青素和木犀草素可能是抑制草鱼未清洗鱼糜凝胶中组织蛋白酶B和L活性的天然抑制剂。其中，原花青素与组织蛋白酶B的GLU190位点和组织蛋白酶L的GLU136位点形成了较强的π-阴离子相互作用，从而提升了结合稳定性。在酶抑制实验中，所有天然化合物都能抑制组织蛋白酶活性及肌球蛋白的降解，其中原花青素的抑制效果最为显著

作者贡献说明

刘健：论文撰写——初稿编写、可视化分析、概念设计。余倩辉：可视化分析、正式数据分析、数据整理。马华伟：论文撰写——审阅与编辑。王堆堆：论文撰写——审阅与编辑。罗永康：论文撰写——审阅与编辑、资金筹集。谭玉清：论文撰写——审阅与编辑、资金筹集、概念设计。洪晖：论文撰写——审阅与编辑、研究监督、资源协调、资金筹集。

伦理审批与参与者同意声明

所有涉及鱼类宰杀和肌肉采样的实验程序均已获得中国农业大学实验室动物福利与动物实验伦理审查委员会的批准（批准日期：2025年3月3日，批准编号：Aw90606202-5-03）。感官评价环节也经过了该委员会的审核，根据机构规定无需再次进行正式伦理审批。在开展感官评价之前，已获得所有参与者的书面知情同意。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关联或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：32172133、32372241）以及CARS计划专项资助（项目编号：CARS-45）的支持。

Jian Lyu|Qianhui Yu|Huawei Ma|Sutee Wangtueai|Yongkang Luo|Yuqing Tan|Hui Hong