《Forensic Science International》：LC-HRMS suspect screening for expanded detection of (new) psychoactive substances in oral fluid: a practical approach for forensic casework
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液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法在法医毒理学中常规用于确认口腔液（OF）中的非法药物。然而，这类方法固有地局限于预定义的分析物，可能无法检测新出现的精神活性物质（NPS）或常规检测 panel 中未包含的化合物。本研究评估了液相色谱-高分辨质谱（LC
液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法在法医毒理学中常规用于确认口腔液（OF）中的非法药物。然而，这类方法固有地局限于预定义的分析物，可能无法检测新出现的精神活性物质（NPS）或常规检测 panel 中未包含的化合物。本研究评估了液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）可疑筛查工作流程的适用性，用于重新分析先前通过常规靶向 LC-MS/MS 方法处理的口腔液提取物，重点关注其在法医案例工作中的应用。口腔液样本（0.25 mL）采用常规用于确认传统非法药物和精神药物的固相萃取程序进行提取。相同的提取物在数据依赖采集模式下通过 LC-HRMS 重新分析。数据处理使用包含 2,376 条条目（其中 1,693 条具有 MS/MS 谱图）的个人化合物数据库与谱库（PCDL）进行，该库基于 HighResNPS 生成并扩充了实验室内部采集的谱图和保留时间。对 105 种可获得的参考标准品进行了定性验证，其中 64.8% 的检出限（LOD）≤10 ng/mL。通过分析来自驾驶员（n=15）、chemsex 使用者（n=6）和急诊科患者（n=4）的 25 份真实口腔液样本，证明了该工作流程的适用性。LC-HRMS 筛查确认了先前通过靶向 LC-MS/MS 检测到的化合物，同时能够识别常规检测 panel 中未包含的其他精神活性物质。该策略为法医毒理学实验室提供了一种补充方法，从现有样本提取物中扩展筛查能力，并支持在常规法医案例工作中改进对新出现 NPS 的监测。
**论文解读：基于LC-HRMS的口腔液中新型精神活性物质可疑筛查策略及其法医应用**
**1. 研究背景与问题**
新型精神活性物质（New Psychoactive Substances, NPS）是指未被联合国药物公约管制，但可能对公共健康构成与公约所列物质类似威胁的新麻醉或精神活性物质。其“新”并非指首次合成，而是指近期在非法使用或黑市中出现的物质。NPS 制造商通过查阅科学文献，寻找制药工业中开发但未上市或未受管制的化合物，或修饰传统毒品化学结构来获得新物质。这些物质常以“研究化学品”、“设计师药物”、“合法兴奋剂”等名义通过网络销售，规避法律监管。欧盟药物署（EUDA）协调的早期预警系统（EWS）目前监测约 1,000 种 NPS，主要分为 13 类，其中合成大麻素、合成卡西酮和苯乙胺类占多数。尽管 NPS 出现高峰在 2013-2015 年，但近年来每年仍有 20-60 种新物质报告，且 2023 年查获量达 41.4 吨，较 2022 年显著增加，持续构成公共卫生威胁。
液相色谱-质谱联用（LC-MS）是分析 NPS 最广泛的技术，但大多数已发表方法基于三重四极杆（QQQ）的靶向检测，仅能识别特定物质或类别。这类方法存在明显局限：首先，NPS 市场快速更迭，基于单位质量分辨率的靶向方法迅速过时；其次，靶向方法需要参考标准品，价格昂贵且许多实验室难以承受，对于最新化合物往往无法获得；第三，遇到未知化合物时，缺乏开发 MS 方法所需的结构信息；第四，靶向方法无法进行回溯性分析，以研究先前样本中特定 NPS 的存在。为应对 NPS 动态变化，液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）逐渐普及，其基于非靶向方法和串联质谱（MS/MS）数据挖掘。高分辨质谱（HRMS）的数据采集可采用数据依赖采集（DDA）模式，在全扫描后根据预设阈值选择前体离子进行 MS/MS 实验，但存在选择随机性、对低浓度化合物检测不足的缺点；数据非依赖采集（DIA）模式则对所有前体离子进行碎裂，但数据处理繁琐且前体-产物离子关系不明确，鉴定置信度较低。目前已有多种 LC-HRMS 方法用于血液和尿液中 NPS 筛查，但口腔液（oral fluid, OF）作为一种非侵入性、易于采集的样本，特别适合道路交通毒物检测和流行病学调查，且主要含有母体化合物，对于代谢未知的新 NPS 分析尤为有用。然而，已发表的口腔液 LC-HRMS 筛查方法数量有限，且化合物库最多仅包含 440 种 NPS。因此，开发适用于口腔液的广谱筛查方法，以覆盖日益增多和多样化的 NPS，具有重要的法医和临床毒理学意义。
**2. 研究内容与结论**
本研究旨在评估一种基于 LC-HRMS 的可疑筛查方法，用于重新分析先前通过常规靶向 LC-MS/MS 方法处理的口腔液提取物，特别关注其在法医案例工作中的实用性，以实现在不增加额外样本前处理的情况下，超越传统靶向检测 panel 的精神活性物质检测能力。研究团队采用固相萃取（SPE）程序提取 0.25 mL 口腔液样本，该程序是实验室常规用于确认传统非法药物和精神药物的方法。提取物随后在 DDA 模式下通过 LC-HRMS 重新分析，并使用包含 2,376 种化合物（其中 1,693 种具有 MS/MS 谱图）的个人化合物数据库与谱库（PCDL）进行数据处理。该库基于 HighResNPS 协作库构建，并添加了实验室内部获取的谱图和保留时间。对 105 种现有参考标准品进行了定性验证，包括选择性、检出限（LOD）、基质效应和残留效应。结果显示，64.8% 的分析物 LOD≤10 ng/mL，满足大多数口腔液分析应用要求。基质效应评估显示，使用 Oral-Eze? 和 Quantisal? 两种采集装置时，多数化合物表现出可接受的信号抑制或增强，但对检测能力影响有限。无残留效应。通过分析 25 份真实口腔液样本（15 份来自驾驶员、6 份来自 chemsex 使用者、4 份来自急诊患者），验证了方法的适用性。LC-HRMS 筛查确认了靶向 LC-MS/MS 检测到的化合物，并额外识别出多种未包含在常规 panel 中的精神活性物质，包括合成卡西酮类 NPS（如氯甲卡西酮 CMC、3-氯卡西酮、甲卡西酮等）、精神药物（如帕利哌酮、奥氮平、西地那非等）及其他化合物（如利多卡因、普鲁卡因等）。在 chemsex 使用者组中检测到高比例的 NPS 和多种药物合用情况，凸显了广谱筛查策略在复杂药物滥用人群中的重要性。该研究为法医毒理学实验室提供了一种补充策略，通过重分析现有样本提取物扩展筛查能力，支持对新兴 NPS 的监测。
**3. 关键技术与方法**
本研究采用的主要技术方法包括：1）固相萃取（SPE）样本前处理：使用 OASIS HLB 反相小柱提取口腔液样本，该程序为实验室常规方法，适用于多种极性化合物；2）液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）分析：采用 Agilent 1290 Infinity II 液相色谱系统耦合 6550 iFunnel QTOF 质谱仪，在正离子电喷雾（ESI）模式下进行数据依赖采集（DDA），每个样本注入两次，使用迭代模式排除首次已碎裂的前体离子，以提高 MS/MS 谱图覆盖率；3）可疑筛查数据库构建：基于 HighResNPS 协作库（2023 年 1 月版本，含 2,287 种化合物），添加实验室内部获取的 MS/MS 谱图和保留时间，以及从 ForensicsTOX_AM PCDL 中提取的药物和氘代标准品谱图，最终构建包含 2,376 种化合物的定制库；4）数据处理与鉴定：使用 MassHunter Qualitative Analysis v10 软件进行 “find by Auto MS/MS” 可疑筛查，采用化合物鉴定标准包括色谱峰、质量精度（≤10 ppm）、同位素丰度、MS/MS 碎片匹配、保留时间（若有标准品）等，并依据 Schymanski 分级报告置信水平。样本队列来源包括：驾驶员（n=15，来自交通管制阳性确认样本）、chemsex 使用者（n=6，来自马德里 Hortaleza 成瘾治疗中心）、急诊患者（n=4，来自加那利大学医院，症状符合中毒但免疫测定排除传统毒品）。研究经加利西亚研究伦理委员会批准（注册号2022/373）。
**4. 研究结果**
**4.1 方法性能**：对 105 种分析物（含 39 种 NPS）进行定性验证。LOD 分布显示，32.4% 分析物 LOD 为 1 ng/mL，19.0% 为 5 ng/mL，13.3% 为 10 ng/mL，16.2% 为 25 ng/mL，6.7% 为 50 ng/mL，12.4% 为 100 ng/mL（包括 6 种苯二氮卓类、3 种 NPS 等）。基质效应方面，Oral-Eze? 装置下 51.4% 分析物无基质效应，27.6% 信号抑制，21.0% 信号增强；Quantisal? 装置下仅 29.5% 无基质效应，69.5% 信号抑制。尽管如此，大多数被抑制化合物仍保持足够的检测能力（约 75% 的抑制化合物 LOD≤25 ng/mL）。两种装置的 CV 均小于 25%（约 90% 分析物），表明重复性良好。未观察到残留效应。
**4.2 真实样本应用**：25 份口腔液样本中，驾驶员组检测到 16 种特异性物质，包括传统非法药物（可卡因及其代谢物、THC、阿片类等）、精神药物（地西泮、劳拉西泮、去甲地西泮、美沙酮、帕利哌酮等）以及 NPS（甲卡西酮、N-甲基-1-苯乙胺等）。Chemsex 使用者组检测到 28 种化合物，其中 21 种为 NPS，主要为合成卡西酮类（如 CMC、3-氯卡西酮、甲卡西酮、MMC 等），且所有样本均显示多药滥用。急诊患者组未检测到 NPS，但检出可卡因、文拉法辛和曲马多等药物。鉴定置信水平多数为 1 级（标准品确认），部分为 2 级（无标准品）或 3 级（异构体或候选物）。该结果展示了 LC-HRMS 筛查在不同人群中的广谱检测能力。
**5. 讨论与结论**
**讨论**：本研究提出的 LC-HRMS 可疑筛查工作流程能够从常规靶向分析后的同一提取物中扩展检测多种精神活性物质，包括 NPS、传统非法药物和精神药物。与已发表的口腔液 LC-HRMS 方法相比，本方法的数据库规模最大（2,376 种化合物），且采用 DDA 模式提高了鉴定置信度，并通过迭代注射克服了低丰度化合物可能漏检的缺点。然而，方法存在一定局限性：仅对 105 种化合物进行了实验验证，其他库条目的分析性能（如 LOD）是推断的；DDA 模式仍可能遗漏与高浓度化合物共洗脱的低丰度分析物；基质效应因采集装置而异，但影响有限。在法医应用中，1 级鉴定可视为确认结果，2 级为推定鉴定，3 级仅为暂定指示，需进一步确认。该策略不应替代靶向定量方法，但可作为补充工具，扩大常规工作流程的检测范围，并支持回溯性分析以应对 NPS 市场的快速变化。
**结论**：本研究证明了基于包含 2,376 种化合物（1,693 种具有 MS/MS 谱图）的库数据库的 LC-HRMS 可疑筛查工作流程，适用于分析先前经常规靶向 LC-MS/MS 处理的口腔液样本。尽管传统滥用药物仍是最常检测到的物质，但 NPS 的持续扩散，尤其是在 chemsex 使用者中，凸显了对适应新兴化合物且不易过时的检测方法的需求。所提出的方法为法医毒理学实验室提供了一个补充工具，以拓宽药物筛查能力并支持在常规案例工作中监测新兴精神活性物质。
