《International Dairy Journal》：Exploring immunomodulatory peptides derived from bovine colostrum protein based on QSAR models: preparation, identification, in vitro activity, and molecular docking analysis
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•通过蛋白酶筛选结合QSAR模型，提高了BCPH制备的效率•BCPH以及小于3 kDa的成分显著提升了巨噬细胞的吞噬活性（p<0.05），并促进了NO和TNF-α等免疫因子的分泌，从而证实了它们的免疫调节作用•KTTMPLW、RDMPIQAF和SRYPSYGL可通过氢键与TLR2
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通过蛋白酶筛选结合QSAR模型，提高了BCPH制备的效率
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BCPH以及小于3 kDa的成分显著提升了巨噬细胞的吞噬活性（p<0.05），并促进了NO和TNF-α等免疫因子的分泌，从而证实了它们的免疫调节作用
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KTTMPLW、RDMPIQAF和SRYPSYGL可通过氢键与TLR2以及TLR4/MD-2发生相互作用
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本研究为牛初乳的高值化利用以及功能性免疫调节食品的开发提供了理论依据和技术支持
引言
免疫系统是维持机体稳态、抵御病原微生物侵袭并清除异常细胞的重要防御网络。它由免疫器官、免疫细胞以及免疫分子组成（Beigoli等人，2024；Wang等人，2024）。在免疫系统中，巨噬细胞充当着先天免疫与适应性免疫之间的桥梁，它们能够呈现抗原、识别并吞噬病原体、清除凋亡细胞、促进组织修复，同时通过调控不同表型间的动态平衡来实现免疫调节功能（Bai等人，2025；T. Liu等人，2025）。当外来病原体入侵时，巨噬细胞会迅速响应微环境的变化，调整自身的极化表型，进而通过多种信号通路调节炎症反应和免疫应答。近年来，由于慢性疾病、衰老和生活方式改变导致免疫功能下降的人群不断增加，因此开发具有天然来源、高安全性且具备免疫调节作用的活性成分，已成为功能性食品研究领域的重点方向（Xu等人，2025）。
食物来源的免疫调节肽是通过酶解、发酵或胃肠道消化从食物蛋白质中释放出的生物活性小分子肽。它们通过调节免疫细胞活化、促进细胞因子分泌以及调控相关信号通路来发挥免疫刺激作用（Chalamaiah等人，2019；Guo等人，2024）。与传统免疫调节药物相比，食物来源的生物活性肽具有分子量低、生物安全性高且易于吸收等优点，因此受到了广泛关注（Chalamaiah等人，2018；Guo等人，2024）。目前已在牛奶（Masotti等人，2011）、鸡蛋（M. W. Chen等人，2022）、大米（Fang等人，2019）、大豆（Ashaolu等人，2017）、鱼类（Hou等人，2012；Kemp等人，2021）以及苋菜（Reyes-Moreno等人，2014）等食物中发现了免疫调节肽。Jiang等人研究表明，从酪蛋白水解物中提取的AMKPWIQPK等生物活性肽，可通过与TLR2/TLR4结合并激活MAPK/NF-κB信号通路，从而发挥强大的免疫调节作用（Jiang等人，2025）。而从狭鳕中提取的FRF、LWR、LFP和PLW等肽类也被证明可以通过TLR2/4通路增强免疫功能（Xu等人，2025）。
分析免疫调节肽的结构与活性之间的关系是当前该领域研究的核心焦点。众多研究表明，免疫调节肽的生物活性与其氨基酸组成、序列长度、疏水性、电荷分布以及空间结构密切相关（Xu等人，2025）。免疫调节肽通常由2到10个氨基酸组成，其中富含精氨酸和赖氨酸等带正电的氨基酸，以及色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等疏水氨基酸。这些结构特征使得它们更容易与TLR2、TLR4以及其他模式识别受体结合，进而激活MAPK和NF-κB等与免疫相关的信号通路，提升巨噬细胞的吞噬能力及细胞因子分泌水平（Jiang等人，2025；Xu等人，2025）。
在肽类制备过程中，对免疫调节肽的筛选至关重要。传统的筛选方法需要开展大量的酶解实验并进行细胞活性验证，不仅实验周期长、成本高，而且筛选效率低下。随着生物信息学的发展，近年来计算技术如虚拟酶解、QSAR建模、PeptideRanker预测以及分子对接逐渐被应用于功能性肽的研究中。这些方法能够在实验之前预测出可能具有活性的肽类，从而提高筛选效率并降低实验成本（Du等人，2023）。例如，Zheng等人首先使用PeptideRanker（阈值大于0.8）筛选出活性肽，再通过ToxIBTL评估其毒性，最后利用UniProt追踪母体蛋白并标注其功能，最终筛选出了四种高活性肽（Zheng等人，2025）。不过，目前关于计算机辅助筛选免疫调节肽的研究仍然相对较少，尤其是应用QSAR模型筛选蛋白酶类型的相关研究几乎空白。此外，越来越多的研究指出免疫调节作用与抗氧化活性之间存在关联。适度的抗氧化能力有助于维持细胞内的氧化还原平衡，保护巨噬细胞功能，并保持免疫应答能力（Morrow等人，2007）。以往的研究曾以DPPH自由基清除活性作为酶解优化的依据，成功获得了具有强大免疫调节活性的功能性肽（X. Q. He等人，2015）。因此，DPPH自由基清除率不仅可以快速评估酶解产物的抗氧化能力，还可以作为酶解过程优化阶段的免疫活性筛选辅助指标，进而提高免疫调节肽的筛选效率。
初乳是指奶牛分娩后的初期所分泌的乳汁。与成熟乳相比，初乳中含有更高量的蛋白质、肽类、脂质、维生素、矿物质、激素、生长因子、细胞因子以及其他化合物，但乳糖含量相对较低（Fajardo-Espinoza等人，2021）。牛初乳的独特之处在于其含有高浓度的免疫球蛋白和乳铁蛋白（McGrath等人，2016）。由于其富含多种免疫成分，牛初乳是制备免疫调节肽的理想来源。目前针对牛初乳的研究主要集中于免疫球蛋白和乳铁蛋白等天然生物活性成分，而通过酶解牛初乳分离免疫调节肽及其作用机制的相关研究则相对有限，这说明这一领域还有很大的发展潜力（R. Liu等人，2024；Wolman等人，2007）。
本研究建立了QSAR模型，用于指导后续蛋白酶的筛选工作。首先对牛初乳进行酶解处理，以DPPH自由基清除活性作为评价指标。通过对酶解条件进行单因素试验和响应面优化，并分析DPPH自由基清除活性与RAW264.7细胞中性红吞噬活性之间的相关性，进而研究了牛初乳蛋白水解物（BCPH）及其小于3 kDa的组分所具有的免疫活性。通过RAW264.7细胞模型对这些水解物进行了分离鉴定，并通过分子对接技术筛选出潜在的免疫调节肽。本研究不仅为牛初乳的高值化利用提供了新的思路，也为新型天然免疫调节剂及功能性食品的开发奠定了理论基础。其研究成果对于推动牛奶来源的生物活性肽在免疫调节领域的应用具有重要的科学意义。
章节要点
材料与试剂
牛初乳粉由中国哈尔滨的黑龙江康普生物技术有限公司提供。α-胰凝乳蛋白酶（1,200 U/mg）和碱性蛋白酶（200,000 U/g）购自Solarbio公司。木瓜蛋白酶（800,000 U/g）和胰蛋白酶（250,000 U/g）则来自上海源业生物技术有限公司。胎牛血清由四季青公司提供，脂多糖来自北京博拓普特科技有限公司，而青霉素链霉素溶液以及CCK-8检测试剂盒则
构建免疫调节肽数据库
通过文献检索以及对BIOPEP-UWM数据库的筛选，本研究构建了一个包含236种免疫调节肽以及236种未被报道具有免疫调节活性的肽类的数据库（表S1）。高质量的数据库是确保QSAR模型良好运行的前提条件。数据库的异质性以及响应值的差异会显著影响QSAR模型的泛化能力和预测性能（Bo等人，2021）。
结论
本研究通过酶解牛初乳蛋白制备了免疫调节肽。在经过虚拟酶解和QSAR模型筛选后，再通过进一步的酶解实验，确定碱性蛋白酶是最适合的酶解酶。通过响应面法优化得到了最佳的酶解条件。体外实验表明，经酶解处理后的产物及其超滤组分显著提升了巨噬细胞的吞噬活性
CRediT作者贡献说明
Ying-Chao Qiu：撰写——初稿撰写、资源获取、数据整理。Zi-Ying Zhao：软件应用、实验研究。Stella Zhu：方法设计。Meng-Jiao Wang：结果验证。Yinghua Zhang：撰写——审稿与编辑、项目监督、资金筹集。Zhi-Shen Mu：项目监督、正式数据分析
未引用参考文献
Beigoli和Boskabady，2024；Kemp和Kwon，2021；Mine和Shahidi，2006；Siamon和Gordon，2016；Zeng等人，2024；Zeng等人，2025。
伦理审批
本文未涉及任何由作者实施的人类受试者或动物实验。
利益冲突声明
? 作者声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本项工作得到了黑龙江省自然科学基金“校企合作”项目（JJ2025XQ0045）的资助。
Ying-Chao Qiu|Zi-Ying Zhao|Stella Zhu|Meng-Jiao Wang|Ying-Hua Zhang|Zhi-Shen Mu
