利用基因组学方法优化产胞外多糖乳酸菌的选育

《International Dairy Journal》：A genomic approach to enhance the selection of lactic acid bacteria producing exopolysaccharides

　　

摘要

乳酸菌因其功能性、防腐性和风味形成特性而被广泛用于发酵食品中。在乳制品中，乳酸菌可通过外多糖的生物合成来调节质地，但并非所有外多糖都能改善质地和感官品质。通过传统的实验室筛选方法（如视觉观察、化学定量）寻找能产生外多糖的菌株十分耗时。本研究采用基于k-mer的基因组策略，快速识别并分类具有合成同聚糖和异聚糖遗传潜能的乳酸菌。利用经过整理的外多糖相关基因数据库，对7个乳酸菌属的537个草图基因组进行了筛选，结果发现有236个菌株具有合成同聚糖的潜能，294个菌株具有合成异聚糖的潜能，它们分别被归为62组和49组。该方法排除了所有不含外多糖基因座的菌株，同时也能有效指示是否存在外多糖相关基因。通过对这些菌株的代表株在添加蔗糖的琼脂上进行分析，发现有11.8%的菌株呈现纤维状，从而加快了为乳制品开发具有质地改良功能的菌株的进程。

引言

乳酸菌与发酵食品密切相关，且被公认为安全微生物。不同菌株的乳酸菌可参与乳酸生成、抗菌作用以及外多糖的就地合成，而这些外多糖能够影响奶酪、酸奶、酸化牛奶和酸面团等食品的黏度、质地、保水能力以及感官体验（Di Cagno等人，2006；Gentès等人，2011；Hassan等人，1996；Rehman等人，2018；Surber等人，2020）。在过去几十年里，人们对外多糖的生成机制及其组成和结构进行了大量研究，而随着“清洁标签”趋势的兴起，这类研究再度受到重视，因为就地合成外多糖可在多种产品中替代食品添加剂。

微生物能够合成多种结构各异的外多糖，这些外多糖在单体组成、连接方式、分支程度、骨架刚性、分子量、电荷以及修饰方面都有所不同（Gentès等人，2011；Hassan等人，1996；Zeidan等人，2017；Zhou等人，2019）。同聚糖由一种重复的单糖构成，比如α-葡聚糖或果聚糖，其合成依赖于一种特定的胞外酶——葡聚糖蔗糖酶或果聚糖蔗糖酶，这类酶能够分解蔗糖，并将葡萄糖或果糖转移到正在生长的聚合物上（Zeidan等人，2017；Zhou等人，2019）。

相比之下，异聚糖则包含多种具有特定结构的糖单体（Zeidan等人，2017；Zhou等人，2019）。异聚糖的生物合成由复杂的基因簇编码，且依赖于已知的Wzx/Wzy依赖性途径（Zeidan等人，2017；Zhou等人，2019）。异聚糖操作子具有较高的基因组多样性。在大多数乳酸菌及致病菌中都存在一个保守的5′区域，即epsABCDE，该区域包含参与异聚糖调控、调节和组装的基因。在这些基因中，启动糖基转移酶负责将第一个糖核苷酸（活化糖）转移到名为十一烯基磷酸的膜结合脂质载体上（Zeidan等人，2017）。研究表明，pGT基因至关重要，因为其失活或删除会完全阻碍异聚糖的生物合成（Dabour & LaPointe，2005；Dertli等人，2013；Minic等人，2007）。在5′保守区域之后，还有两个或更多基因负责编码糖基转移酶，这些酶共同完成异聚糖重复单元的构建。这些酶的性质直接影响外多糖的分子组成、排列方式以及连接结构（Lynch等人，2018；Zhou等人，2019）。重复单元通过翻转蛋白被转运到细胞质膜外侧，再由Wzy蛋白进行聚合反应（Zeidan等人，2017）。

传统的外多糖检测方法包括观察纤维状/黏液状表型、染色、黏度测量、化学定量以及外多糖特征分析（Fessard & Remize，2019；Malang等人，2015；Surber等人，2020；Surber等人，2019）。虽然这些方法都能得到不错的结果，但耗时且需要较多资源。近年来，人们开发出了新的高通量表型分析方法，比如测量微生物培养物中的吸力或通过其中的交流电强度（Bancalari等人，2019；Poulsen等人，2019；Poulsen等人，2020）。通过特异性PCR扩增或基因表达检测来针对同聚糖/异聚糖基因位点，通常被用作验证手段或作为筛选方法的补充（Bancalari等人，2019；Fessard & Remize，2019；Malang等人，2015）。基于实验室分析或基因组分析，有一些研究开发出了根据乳酸菌的外多糖组成或功能对其进行分类的方法（Deo等人，2019；Mozzi等人，2006；Surber等人，2019；Van der Meulen等人，2007；Vaningelgem等人，2004）。根据乳酸菌的外多糖相关功能对其分类，有助于在筛选多种菌株的集合时更快找到有潜力的菌株。

本研究提出了一种生物信息学方法，利用经过整理的同聚糖和异聚糖基因数据库，直接从草图基因组中判断菌株的产外多糖潜力，根据共有的外多糖基因特征对菌株进行分类，同时筛选出有望通过表型验证的菌株，进而排除所有不含外多糖相关基因的菌株。本研究共分析了属于7个不同乳酸菌属的537个草图基因组，其中包括乳杆菌属、链球菌属、乳球菌属、白乳链球菌属、魏斯氏菌属、片球菌属以及丙酸杆菌属的菌株。其中，有236个菌株被认为具有合成同聚糖的潜能，294个菌株被认为具有合成异聚糖的潜能（部分菌株同时属于这两类），这些菌株分别通过最大距离法和堪培拉距离法进行了UPGMA聚类分析。为了验证外多糖的生成情况，并确认基因组聚类方法在识别产外多糖菌株方面的有效性，还对各聚类组的代表株在添加蔗糖的琼脂上进行了纤维状表型检测。

章节节选

基因组数据

这537个乳酸菌菌株的草图基因组序列是由通用磨坊公司和优乐氏公司，在与美国犹他州普罗沃市杨百翰大学的合作下提供的，其中包括280个乳杆菌属菌株（Zheng等人，2020）、52个嗜热链球菌菌株、89个乳酸乳球菌菌株、40种白乳链球菌菌株、32种魏斯氏菌菌株、24种片球菌菌株以及20个弗洛伦德雷希丙酸杆菌菌株。这些序列是通过Illumina MiSeq技术（美国加利福尼亚州圣地亚哥的Illumina公司）测序得到的125碱基对的配对末端读段，随后通过相应技术进行了组装。

基于k-mer的策略用于聚类潜在产外多糖菌株

本研究开发了一种生物信息学方法，用于根据乳酸菌合成外多糖的遗传潜能对它们进行重新分类。同聚糖是由高度同源基因编码的单一胞外酶合成的，这一特点使得所有类型的乳酸菌都可以被归为一类（Leemhuis等人，2013；Lynch等人，2018；Zeidan等人，2017；Zhou等人，2019）。

由于异聚糖的生物合成依赖于多基因操作子，因此检测异聚糖需要更为复杂的方法。为此，研究人员专门构建了一个pGT基因数据库。

结论

本研究表明，基于k-mer的基因组聚类方法可作为高通量工具，用于识别具有外多糖生物合成能力的细菌菌株。这种方法可在实验室筛选之前使用，从而缩短时间、减少工作量和成本。虽然它并非直接测定外多糖的生成量，但能够提高找到产外多糖菌株的概率。细菌是根据k-mer的数量来进行分类的，

资金支持

本研究得到了加拿大基因组计划、魁北克基因组计划、通用磨坊公司和优乐氏公司（基因组应用合作伙伴计划，GAPP）的支持，同时还获得了加拿大自然科学与工程研究委员会的资助（NSERC，RGPIN-2023-04878）。Thomas Messier还获得了加拿大乳业委员会和Novalait的奖学金支持，Charlotte Marchand则获得了Initia基金会（Transfo：Inno）、INAF以及Novalait的奖学金支持。

CRediT作者贡献说明

Thomas Messier：正式分析、方法学、原文撰写、审稿与编辑。 Charlotte Marchand：正式分析、方法学、原文撰写、审稿与编辑。 Marie-Hélène Lessard：概念设计、正式分析、方法学、监督、审稿与编辑。 Adèle Miteul：正式分析。 Pier-Luc Plante：方法学。 Sébastien Fraud：概念设计、资金获取、项目管理、资源协调。 Donna Miller：资金支持。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。

致谢

作者感谢加拿大基因组计划和魁北克基因组计划的技术团队在生物信息学计算方面所提供的帮助。

Thomas Messier|Charlotte Marchand|Marie-Hélène Lessard|Adèle Miteul|Pier-Luc Plante|Sébastien Fraud|Donna Miller|Sylvie L. Turgeon|Steve Labrie