人类TBC1结构域含激酶属于I类多结构域假激酶

《Protein Expression and Purification》：Human TBC1 domain-containing kinase is a class I multidomain pseudokinase

　　

摘要

TBCK相关脑病（TBCKE）是一种与基因双等位基因突变相关的神经发育障碍。尽管全球报告的病例数量不断增加，但TBCK的生化及生物物理特性仍不明确，这阻碍了对其在疾病中作用的分子层面理解。在此，我们报道了利用Spodoptera frugiperda细胞成功表达并纯化出全长人类TBCK蛋白。生化及生物物理分析表明，TBCK的催化无活性的假激酶结构域缺乏核苷酸结合能力，这与催化作用所必需的典型VAIK、HRD和DFG结构 motif的缺失一致。这些发现支持TBCK属于I类假激酶，并为未来开展其结构与功能研究、明确其生物学作用奠定了基础。

引言

TBCK脑神经元病（TBCKE），也被称为TBCK综合征，或婴儿期肌张力低下伴运动发育迟缓及特征性面容3型，是一种常染色体隐性遗传的先天性神经发育障碍¹。自2015年首次被确认为一种独立的临床疾病以来，全球已有超过60例该病患者被报道，如今它已被视为一种严重的先天性神经发育异常²。患病者会出现严重的全面发育迟缓，以及智力与运动能力双重受损，通常还伴有巨颅、轴向肌张力低下、癫痫发作，以及语言能力和自主运动能力显著缺陷^{3, 4}。基因分析表明，TBCKE是由编码含TBC1结构域激酶（TBCK）的基因中的双等位基因致病变异引起的^{1, 5, 6, 7}。

近期研究将TBCK确定为Rab5和RNA/核糖体中间体（FERRY）复合体的关键组成部分，该多蛋白复合物在早期内体转运过程中充当Rab5A的效应因子^{8, 9}。有研究提出FERRY复合体可介导mRNA在内体途径中的结合与运输，这表明TBCK的功能、囊泡转运过程与神经元发育之间存在直接的分子关联。尽管取得了这些进展，但TBCK本身的生化活性及生物物理特性仍不明确，这限制了人们对疾病相关变异如何干扰神经发育过程的机制理解。

据推测，TBCK由从N端到C端依次排列的三个独立结构域组成：一个假激酶结构域、一个Tre2-Bub2-Cdc16（TBC）结构域，以及一个类似罗丹酶的结构域，这些结构域之间通过短连接区相连（图1a）。生物信息学分析显示，该假激酶结构域缺乏丝氨酸/苏氨酸激酶活性所必需的典型催化结构 motif，包括富含甘氨酸的环结构、VAIK、HRD和DFG结构 motif（图1b），这一结果支持将TBCK归类为I类假激酶。虽然序列分析有助于识别假激酶的典型特征，但也有许多已标注的假激酶由于在典型活性位点内部或附近存在替代残基，而保留了意想不到的配体结合能力或残余的酶活性^{10, 11}。因此，实验验证对于确定各类假激酶的功能分类及生化特性而言至关重要。

尽管人们对TBCK的生物学及病理学作用极为关注，但目前尚未有报道能够制备出作为独立蛋白的全长人类TBCK。据我们所知，现有的研究仅将TBCK视为FERRY复合体的组成部分，在这些研究中，TBCK会与其他FERRY复合体组分一同表达并共同纯化，属于更高阶的多蛋白组装体的一部分⁹。虽然这些研究有助于了解TBCK的细胞功能，但无法用于评估该蛋白自身的内在生化特性。在本研究中，我们报告了TBCK的成功表达、纯化以及体外生化特性分析。这些基础性分析为直接检测TBCK假激酶结构域的功能潜力提供了依据，同时也为理解TBCK功能异常如何在细胞中发挥其生物学作用奠定了生化基础，有望为未来TBCKE的诊断与治疗策略的开发提供参考。

章节节选

载体设计与bacmid制备

人类TBCK的典型氨基酸序列取自UniProt数据库（Q8TEA7）。我们在TBCK序列的C端添加了一个可被TEV酶切割的His-10标签（AGENLYFQGHHHHHHHHHH）。为了便于在Spodoptera frugiperda（Sf9）昆虫细胞中使用杆状病毒表达系统进行异源表达，我们对TBCK的DNA序列进行了密码子优化。该< />基因由GenScript公司（位于新泽西州皮斯卡特维）合成，并被克隆到pFastBac1载体上，插入BssHII和XhoI限制性内切酶切位点之间。该基因的序列为

TBCK的表达与纯化

我们选择杆状病毒表达系统来重组生产人类TBCK，因为该系统以能够高效产生大量正确折叠的人类蛋白质而著称¹⁹。我们将初始浓度为2 × 10⁶细胞/毫升的杆状病毒感染到Sf9细胞中。通过测试不同的感染复数和表达时间，我们对表达条件进行了优化。在所有测试条件下，感染复数为1时能获得最高的TBCK产量，且收获时细胞的存活率可保持在97%。TBCK的表达情况为

讨论

TBCK是一种“暗型”蛋白激酶，在多种重要的细胞通路中发挥着关键作用，包括mTOR信号通路、自噬作用、溶酶体功能、线粒体分裂、细胞增殖以及细胞内囊泡转运过程²⁶。在体外条件下对其生化及生物物理特性进行表征，为理解与TBCK相关的疾病奠定了基础。

通过生物信息学分析，迄今为止已报道了近900种与该基因相关的突变，其中超过100种被归类为或被预测为致病性突变

结论

本研究通过杆状病毒表达系统实现了全长人类TBCK的重组表达与纯化，同时还首次对该蛋白进行了体外生化特性分析。我们的研究结果支持将TBCK归类为I类假激酶，这类假激酶缺乏可检测的核苷酸结合能力与水解活性。这些结果揭示了TBCK的生化及生物物理特性，为未来进一步研究其分子功能奠定了基础

CRediT作者贡献说明

Anthony Iavarone：撰写——审阅与编辑、方法学、数据整理。Wen Zhu：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、研究指导、实验开展、资金获取、正式数据分析、概念构思。Shiwangi Maurya：初稿撰写、可视化分析、实验开展、正式数据分析、数据整理、概念构思。Lilly Cheek：初稿撰写、可视化分析、数据整理

致谢

本项工作部分得到了佛罗里达州立大学（FSU）的启动资金支持，以及FSU儿童罕见病研究所的资助，同时还获得了美国国立卫生研究院的经费支持（R35GM160337项目资助给WZ，1S10OD020062-01项目资助给ATI）。作者们还要感谢FSU分子生物物理学研究所蛋白质生物物理学实验室、FSU分子生物物理学研究所蛋白质表达实验室以及FSU生物科学系的Peter Randolph博士、Gwimoon Seo博士、Brian K. Washburn博士和John M. Schulze博士的帮助

Shiwangi Maurya|Lilly E. Cheek|Anthony T. Iavarone|Wen Zhu

佛罗里达州立大学化学与生物化学系，佛罗里达州塔拉哈西市，邮编32306