《Protein Expression and Purification》：Combining gene amplification with SEAP-reporter to achieve high expression of recombinant omicron XBB.1.5 spike protein
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摘要目前最稳定的哺乳动物重组蛋白表达方法依赖于耗时的ELISA技术，需使用针对特定目标的抗体来筛选高表达克隆。一些无需抗体的替代报告系统，比如利用细胞内绿色荧光蛋白的系统，虽然简化了表达克隆的筛选过程，但往往会导致表达产量较低。我们此前已开发出一种基于谷氨酰胺合成酶的可扩增基因表
摘要
目前最稳定的哺乳动物重组蛋白表达方法依赖于耗时的ELISA技术，需使用针对特定目标的抗体来筛选高表达克隆。一些无需抗体的替代报告系统，比如利用细胞内绿色荧光蛋白的系统，虽然简化了表达克隆的筛选过程，但往往会导致表达产量较低。我们此前已开发出一种基于谷氨酰胺合成酶的可扩增基因表达系统，用于高效表达那些难以表达的重组蛋白。在此，我们通过引入一种分泌型胚胎碱性磷酸酶作为报告蛋白，进一步优化了这一基于GS的表达系统，从而实现了无需抗体即可高效筛选出强表达的重组蛋白克隆。我们将该GS与SEAP结合的方法用于表达一种相对难以表达的蛋白质——可溶性的三聚体SARS-CoV-2奥密克戎XBB.1.5刺突蛋白，最终获得了超过130毫克/升的纯化蛋白产量。这一数值是迄今为止在HEK293细胞中获得的冠状病毒刺突蛋白三聚体最高表达水平。因此，基因扩增技术与简单高效的筛选方法相结合，形成了一种高通量、高产量的重组蛋白表达系统。
引言
重组蛋白的生产是现代生物技术的核心，其应用范围涵盖结构生物学、诊断技术、疫苗研发以及治疗性产品制造等多个领域。在现有的重组蛋白表达系统中，基于哺乳动物细胞的平台因其能够实现类似人体的糖基化作用，并确保蛋白的结构和功能完整性，而成为生产生物制药蛋白的首选[1]。在稳定的哺乳动物表达系统中，通常通过单细胞克隆技术，从含有随机整合基因构建体的混合群体中筛选出那些表达水平最高、能稳定转染的重组蛋白克隆[2]。最常用的单细胞分离方法是有限稀释克隆法，随后通过ELISA等方法测定每个克隆上清液中的蛋白表达水平[2,3]。ELISA是一种灵敏且特异的方法，但其通量较低，且需要高亲和力的抗体对[4]。为避免繁琐的ELISA筛选，人们常常采用大规模瞬时表达技术。此外，还包括绿色荧光蛋白及其变体在内的报告蛋白也被广泛用于筛选高表达的重组克隆[5,6]。当使用细胞内表达的GFP作为报告蛋白时，可通过流式细胞术辅助的细胞分选来实现高通量的克隆筛选。然而，分选后的细胞通常为多克隆群体，因此在培养过程中可能会丢失那些高表达的细胞[7]。另外，有研究指出，在高表达克隆中，GFP在细胞内的积累具有细胞毒性[[8], [9], [10]]。
我们曾开发出一种基于基因扩增的重组蛋白表达系统，利用谷氨酰胺合成酶来实现多种难以表达蛋白的高效表达[11,12]。为了进一步建立一种高通量、无需抗体的报告系统，同时规避GFP报告蛋白存在的诸多限制，我们将这种可扩增的GS表达系统与分泌型胚胎碱性磷酸酶相结合——后者在信号转导研究中被广泛使用[[13], [14], [15]]。SEAP的表达与中国仓鼠卵巢细胞中的GS表达相耦合，以此反映目标基因的扩增情况。为验证该系统的有效性，我们尝试表达了来自SARS-CoV-2奥密克戎变异株的一种较为难以表达的冠状病毒刺突蛋白三聚体。截至2026年3月，新冠疫情已在全球范围内导致超过7.79亿例确诊病例和700万人死亡[16]。在所有SARS-CoV-2变异株中，奥密克戎变异株及其亚型在大约两年时间里成为美国及其他许多地区的主要流行毒株，引发了最多的感染病例[17,18]。刺突蛋白通过血管紧张素转换酶2受体在病毒进入宿主细胞的过程中起着关键作用，同时也是中和抗体、疫苗以及诊断试剂的主要靶标[19]。在疫情初期，由于表达水平较低，很难在哺乳动物细胞中生产重组刺突蛋白[20]。目前，许多冠状病毒刺突蛋白三聚体是通过生物反应器或中国仓鼠卵巢细胞进行大规模瞬时表达来生产的[21,22]。不过，在HEK293细胞中的表达水平仍不尽如人意[21,23]，而这类细胞之所以被优先用于刺突蛋白的生产，是因为它们能够在蛋白上生成类似人体的糖链[24]。
在此，我们证明了GS-SEAP联合表达系统能够高效地进行克隆筛选，并在HEK293细胞中实现了高产量的奥密克戎刺突蛋白表达。该系统为在哺乳动物细胞中实现无需抗体且高产量的蛋白生产提供了一种通用策略。
章节节选
质粒构建
为构建GS-SEAP表达载体，我们首先合成了编码心肌炎病毒内部核糖体进入位点以及SEAP序列的DNA片段[25][13]，然后将这些片段插入到先前描述过的pcDNA-GS质粒[11]中——该质粒包含中国仓鼠卵巢细胞GS的开放阅读框，位于XhoI和XbaI限制性内切酶切位点之间。由此得到的载体被命名为pIAG。而对于SARS-CoV-2刺突蛋白（奥密克戎XBB.1.5变异株）的表达，则需要使用一个合成基因，该基因编码序列为1–1204位氨基酸（GenBank编号：OQ338223.1）。
SEAP报告系统与GS表达系统的建立
要建立能够大量生产重组蛋白的稳定细胞系，通常需要使用针对特定目标、成本高昂且操作复杂的ELISA技术对大量克隆进行筛选。为此，人们开发了基于报告蛋白的筛选系统来替代ELISA，其中最常见的是利用细胞内表达的荧光蛋白，比如绿色荧光蛋白[27,28]。借助这类系统，可以通过流式细胞术快速筛选出高表达克隆，但是
结论
我们成功开发出一种新型的哺乳动物表达系统，该系统将基于SEAP的克隆筛选技术与谷氨酰胺合成酶驱动的基因扩增技术相结合。这一系统不仅能够高效筛选出高表达克隆，还有助于实现重组蛋白的高产量生产。利用该系统，我们成功在HEK293细胞中表达了功能性SARS-CoV-2奥密克戎XBB.1.5刺突蛋白以及其他蛋白，并获得了较高的产量。该平台具有操作简单、可扩展性强且成本较低等优点，具备广泛的应用潜力。
CRediT作者贡献说明
邹忠成：数据整理、研究实施、方法设计、结果验证、初稿撰写、论文修订。 孙彼得·D：概念构思、资金筹集、项目管理、初稿撰写、论文修订。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了美国国立卫生研究院内部研究计划、国家过敏和传染病研究所以及美国国立卫生研究院的支持。参与研究的NIH作者们所做的工作属于其作为NIH联邦雇员应履行的职责，符合该机构的政策要求，属于美国政府的工作成果。不过，本文中所呈现的研究发现和结论均为这些作者个人的研究成果。
Zhongcheng Zou|Peter D. Sun
结构免疫学组，免疫遗传学实验室，国家过敏和传染病研究所，美国马里兰州罗克维尔市，20852
