可现场使用的种子健康检测方法：基于RT-RPA技术检测芥菜叶片及种子中的芜菁花叶病毒

《BMC Plant Biology》：Field-deployable seed health diagnostic assay: RT-RPA-based detection of turnip mosaic virus in mustard leaf and seed lots

　　

摘要

芜菁花叶病毒（TuMV）是芥菜种植中的主要障碍，有证据表明该病毒可通过种子传播，这为其远距离扩散和疾病爆发带来了重大风险。因此，迫切需要针对种子健康检测的快速且灵敏的检测方法。在本研究中，针对TuMV的衣壳蛋白（CP）基因，优化了一种逆转录重组聚合酶扩增（RT-RPA）检测方法，该方法可在多种芥菜组织中应用，包括成熟种子。该检测在42℃下进行25分钟，具有极高的分析灵敏度，能够检测到浓度低至10飞克级的病毒RNA，尤其是在粗提物中，其性能比传统RT-PCR高出2到3个数量级。使用0.1 M磷酸盐缓冲液进行简化的粗提操作，无需RNA纯化即可直接进行扩增，而且该检测方法与羟基萘酚蓝（HNB）兼容，可实现可视化、比色检测，适用于田间应用。通过对不同基因型和田间样本的验证，发现RT-RPA与RT-PCR的结果完全一致。为确定实用的种子健康检测阈值，研究了两种种子大小不同的芥菜品种的种子组合。通过RT-qPCR对RT-RPA结果进行了定量验证，发现定性检测与定量检测结果高度一致。在大种子基因型中，仅需2–6粒种子的粗提物即可实现可靠检测；而在小种子基因型中，则需要15–25粒种子，这体现了种子大小对检测灵敏度的影响。本研究开发并验证了首个基于粗提物的RT-RPA检测方法，可用于检测芥菜植株各部位，包括种子样本中的TuMV感染情况。该方法为快速、灵敏且适合田间应用的种子健康检测提供了符合ISTA（国际种子检验协会）标准的检测框架。

图表摘要

芜菁花叶病毒（TuMV）是芥菜种植中的主要障碍，有证据表明该病毒可通过种子传播，这为其远距离扩散和疾病爆发带来了重大风险。因此，迫切需要针对种子健康检测的快速且灵敏的检测方法。在本研究中，针对TuMV的衣壳蛋白（CP）基因，优化了一种逆转录重组聚合酶扩增（RT-RPA）检测方法，该方法可在多种芥菜组织中应用，包括成熟种子。该检测在42℃下进行25分钟，具有极高的分析灵敏度，能够检测到浓度低至10飞克级的病毒RNA，尤其是在粗提物中，其性能比传统RT-PCR高出2到3个数量级。使用0.1 M磷酸盐缓冲液进行简化的粗提操作，无需RNA纯化即可直接进行扩增，而且该检测方法与羟基萘酚蓝（HNB）兼容，可实现可视化、比色检测，适用于田间应用。通过对不同基因型和田间样本的验证，发现RT-RPA与RT-PCR的结果完全一致。为确定实用的种子健康检测阈值，研究了两种种子大小不同的芥菜品种的种子组合。通过RT-qPCR对RT-RPA结果进行了定量验证，发现定性检测与定量检测结果高度一致。在大种子基因型中，仅需2–6粒种子的粗提物即可实现可靠检测；而在小种子基因型中，则需要15–25粒种子，这体现了种子大小对检测灵敏度的影响。本研究开发并验证了首个基于粗提物的RT-RPA检测方法，可用于检测芥菜植株各部位，包括种子样本中的TuMV感染情况。该方法为快速、灵敏且适合田间应用的种子健康检测提供了符合ISTA（国际种子检验协会）标准的检测框架。

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