B细胞在成骨稳态中的重要性

《Cell Communication and Signaling》：The importance of B cells for osteogenic homeostasis

　　

针对白血病和自身免疫性疾病等疾病的治疗性干预措施越来越多地被设计为在长期内选择性靶向和耗竭特定的免疫细胞亚群。这可能会破坏适应性免疫系统的稳态，不仅影响外周血，还影响“免疫系统的摇篮”——骨髓。研究人员假设，这种由免疫细胞耗竭疗法导致的免疫失衡会损害间充质基质细胞（MSCs）的分化能力，MSCs是骨细胞的关键前体，因此对维持骨骼健康至关重要。为了验证这一假设，研究人员进行了一系列细胞培养实验，用来自不同免疫细胞亚群的免疫条件培养基刺激MSCs。采用综合分析方法评估分化中的MSCs，包括其相关上清液、沉积的胶原蛋白、矿化基质以及在成熟过程中特定时间点的脂质沉积。因此，进行了荧光和非荧光组织化学染色、酶联免疫吸附试验（ELISAs）以及核糖核酸（RNA）表达分析。该研究表明，与来自T细胞或外周血单核细胞（PBMCs）的免疫条件培养基相比，富含白细胞介素4、骨形态发生蛋白2和Dickkopf 1的B细胞免疫条件培养基在体外增强了MSCs的成骨分化。这种积极的成骨效应主要由受刺激B细胞分泌的细胞因子升高驱动，在体内，这些细胞因子可能进而刺激骨转换并调节免疫系统功能。总之，这些数据表明B细胞对体外分化中的MSCs具有促成骨和促脂肪形成的作用，提示骨髓中免疫细胞的失衡会扰乱骨稳态。

**研究背景与问题**
骨骼是肌肉骨骼系统的重要组成部分，也是初级淋巴器官，凸显了免疫系统与骨骼系统之间的紧密联系。骨髓中栖息着造血干细胞（HSCs）和免疫前体细胞。骨免疫学这一新兴交叉学科揭示了骨骼与免疫系统之间的动态相互作用，这些相互作用对维持骨骼组织稳态以及免疫和骨骼疾病的发病机制至关重要。异常免疫激活可刺激骨细胞（如破骨细胞和成骨细胞），破坏骨重塑，可能导致骨骼疾病。反之，骨髓中的复杂多细胞网络创造了特殊的微环境，对维持和分化HSCs及其后代至关重要。在骨髓移植前的清髓性治疗中，这种复杂相互作用的失调会发生。细胞密度的轻微变化或特定细胞类型的缺失会显著影响机体的整体再生能力。早期研究集中于先天免疫系统在骨再生过程中的作用，发现其刺激骨祖细胞分化为破骨细胞，这一过程对清除受损组织和为随后的成骨细胞活动准备部位至关重要。后续研究表明T细胞也能诱导破骨细胞形成，从而确立了骨免疫学领域。这一新知识扩展了适应性免疫系统对再生过程影响的研究。

病理事件后，骨骼是少数能完全再生的组织之一，包括骨折后无瘢痕愈合以及清髓性治疗（如化疗和放疗）后骨髓的重建，为干细胞移植做准备。成功再生依赖于骨微环境中基质细胞和免疫细胞之间的协调互动，这是骨髓龛内免疫和骨细胞分化所需环境的必要前提。近期研究证明了脂肪细胞在维持骨稳态和促进再生中的关键作用，其与血管和成骨细胞的紧密联系凸显了其在骨骼生物学中的重要性。因此，基质细胞的成脂分化能力成为再生医学领域的焦点。

清髓性治疗（包括放疗、化疗和全身照射）会破坏骨髓结构和骨髓龛。骨髓重建对于接受此类治疗的患者恢复骨稳定性和免疫功能至关重要。全身照射已被证明会导致骨量减少和骨质疏松风险升高，表明骨髓环境的重建需要时间，在此期间，紊乱的免疫-骨骼相互作用导致骨丢失。研究人员先前在模拟干细胞移植的临床前模型中显示，移植中使用的HSCs类型也会影响骨和骨髓的时间依赖性重建，以及骨髓内免疫细胞种群的恢复。骨髓成分分析揭示了免疫失衡破坏了骨稳态。清髓性治疗和造血干细胞移植（HSCT）后的骨重建需要完整骨髓龛的重建。骨髓龛包含多种细胞，包括间充质干细胞/基质细胞（MSCs）、内皮细胞、前成骨细胞和成骨细胞。HSCs也驻留在骨髓的特殊龛中，直到成熟被诱导，期间它们在不同龛之间迁移并分化，直至完全成熟后释放入血。破坏正常骨髓结构的创伤事件或治疗会损害造血，常导致局部免疫细胞组成的重建不足。

近年来，越来越多研究关注免疫细胞亚型（尤其是B细胞）耗竭对多种自身免疫性疾病的影响。这些疗法导致骨和骨髓中免疫细胞失衡。研究人员假设，适应性免疫细胞区室的失衡会改变MSCs的分化能力，从而影响骨髓龛。为探究此问题，研究人员检查了特定免疫细胞群及其比例变化如何影响MSCs的成骨和成脂分化潜能，并旨在阐明驱动这些骨形成改变的机制。总之，本研究结果表明，在新治疗策略的开发阶段，应考虑对免疫骨的影响，进而对骨骼健康的影响。

**研究概述与结论**
研究人员开展了一系列细胞培养实验，利用来自不同激活免疫细胞（B细胞、T细胞、外周血单核细胞PBMCs以及混合淋巴细胞反应MLR）的免疫条件培养基刺激人骨髓MSCs，通过组织化学染色、多重ELISA和RNA测序等方法，评估MSCs的成骨和成脂分化能力。研究表明，与T细胞或PBMCs免疫条件培养基相比，B细胞免疫条件培养基显著增强了MSCs的矿化基质沉积和胶原蛋白产生，同时维持了脂肪细胞形成；而MLR、PBMC和T细胞条件培养基则抑制了这些过程。B细胞条件培养基富含白细胞介素4（IL-4）、骨形态发生蛋白2（BMP-2）和Dickkopf 1（DKK-1）等促骨转换因子，并诱导MSCs分泌抗炎细胞因子和促成骨因子。RNA测序显示，B细胞条件培养基降低了与移植物抗宿主病和同种异体移植排斥反应相关基因的表达，而MLR条件培养基则上调了这些基因。该研究揭示了B细胞在维持骨稳态中的关键作用，提示在靶向免疫细胞的治疗中需考虑B细胞对骨骼健康的影响。论文发表在《Cell Communication and Signaling》。

**主要技术方法**
研究人员从一名健康供体外周血中分离PBMCs、B细胞和T细胞，通过特定刺激（如抗CD3/CD28抗体激活T细胞，抗IgM和IL-4激活B细胞，以及混合淋巴细胞反应）制备免疫条件培养基。MSCs来源于六名接受髋关节手术的人供体骨髓，通过密度梯度离心法分离并扩增。将MSCs在成骨或成脂分化培养基中培养21天，同时添加1:4稀释的免疫条件培养基。通过茜素红染色（矿化基质）、尼罗红染色（脂滴）和天狼星红-固绿染色（胶原蛋白）评估分化，并通过Hoechst染色量化细胞数。使用多重ELISA检测骨代谢和免疫反应相关细胞因子。对分化后的MSCs进行RNA测序以分析基因表达变化。

**研究结果**
**免疫条件培养基的效能由分泌的细胞因子决定**
通过多重ELISA量化免疫条件培养基中的细胞因子水平。MLR条件培养基中DKK-1、IL-8、IP-10、IFNγ和MCP-1升高；PBMC条件培养基中ACP-5、DKK-1、OPN、IL-8、IL-2、IFNγ、MCP-1和TNFα升高；T细胞条件培养基中TNFα、IL-2和IFNγ升高；B细胞条件培养基中PTH、ALPL、BMP-2、DKK-1、瘦素、OPG、IL-6、IL-1β和IL-4升高，表明激活B细胞分泌促进骨转换（包括骨吸收和骨形成）以及促炎和抗炎反应的因子。

**MSCs成骨和成脂分化能力在免疫条件培养基刺激后的差异**
通过茜素红染色评估矿化基质沉积，天狼星红-固绿染色评估胶原蛋白，尼罗红染色评估脂肪细胞形成。MLR、PBMC和T细胞条件培养基对矿化基质沉积无显著影响，而B细胞条件培养基显著增加矿化基质沉积。MLR、PBMC和T细胞条件培养基降低了胶原蛋白产量，B细胞条件培养基无此负面效应。MLR、PBMC和T细胞条件培养基减少脂肪细胞形成，B细胞条件培养基则不影响。分化第21天的多重ELISA显示，B细胞条件培养基刺激的MSCs分泌更多骨代谢相关因子（如PTH、ACP-5、RANKL、OPN、ALPL、BMP-2、DKK-1、瘦素、OPG、IL-6、TNFα、IL-1β），同时减少促炎细胞因子（IL-2、IL-6、IL-8、IL-12p70）并增加抗炎细胞因子（IL-4、IL-10）。

**免疫条件培养基对分化MSCs基因表达的影响**
对未刺激或MLR、B细胞条件培养基刺激的分化MSCs进行RNA测序。MLR条件培养基诱导了与移植物抗宿主病和同种异体移植排斥反应相关基因（如IL-6、HLA亚型、补体成分C2/C3/C6/C7、CXCL9/11/13、CCL19）的上调。B细胞条件培养基仅轻微增加IL-6表达，且未上调补体和HLA基因。在细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号和抗原加工呈递相关基因中，MLR条件培养基上调了CXCL1/2/5、CCL20等促炎趋化因子，而B细胞条件培养基上调了CCL26（嗜酸性粒细胞趋化因子）并降低了抗原呈递相关基因（如CD274、CCL5、CXCL10）的表达。

**总结与讨论**
本研究揭示了B细胞在维持骨稳态中的关键作用。与T细胞或PBMC条件培养基相比，B细胞条件培养基通过分泌促骨转换因子（如BMP-2、DKK-1、IL-4）和抗炎细胞因子，促进MSCs成骨分化和基质矿化，同时维持脂肪细胞形成，可能为骨再生提供能量支持。而T细胞和MLR条件培养基通过诱导促炎微环境抑制MSCs分化。B细胞条件培养基还降低了与移植物抗宿主病和排斥反应相关基因的表达，提示B细胞可能通过调控免疫-骨骼相互作用促进骨健康。尽管研究存在局限性（如免疫细胞仅来自单一供体），但结果强调了在治疗中靶向免疫细胞时需考虑B细胞耗竭对骨骼的潜在负面影响。结论：B细胞通过分泌促骨转换和免疫调节因子，对体外MSCs分化具有促成骨和促脂肪形成作用，其失衡会扰乱骨稳态，提示维持B细胞与T细胞的平衡对骨骼健康至关重要。