《Neurological Research and Practice》：A mechanosensitive gene signature associated with immune landscape and survival in glioma: a multi-cohort analysis
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摘要
背景
胶质瘤具有显著的分子异质性和不良临床结局。 emerging证据提示，机械传导相关通路可能影响肿瘤进展和免疫重塑。然而，机械敏感基因在胶质瘤中的预后相关性仍不明确。
方法
研究人员分析了来自TCGA、CGGA-301、CGGA-325和GSE160
摘要
背景
胶质瘤具有显著的分子异质性和不良临床结局。 emerging证据提示，机械传导相关通路可能影响肿瘤进展和免疫重塑。然而，机械敏感基因在胶质瘤中的预后相关性仍不明确。
方法
研究人员分析了来自TCGA、CGGA-301、CGGA-325和GSE16011队列的RNA测序数据和临床信息。机械敏感基因从精选基因集中鉴定，并利用LASSO和Cox回归分析构建预后特征。评估了免疫浸润、免疫检查点表达、TIDE预测和药物敏感性。风险评分在四个独立队列中与SPP1表达持续呈正相关，单细胞分析进一步提示SPP1相关信号可能有助于免疫微环境重塑。通过qRT-PCR在胶质瘤细胞系中验证了所选基因。
结果
一个九基因机械敏感特征将胶质瘤患者分为高风险和低风险组，多个队列中两组总生存期差异显著。风险评分与既定临床病理因素独立相关，包括WHO分级、IDH突变状态、1p/19q联合缺失状态和MGMT启动子甲基化状态。高风险肿瘤表现出巨噬细胞和中性粒细胞浸润增加、免疫检查点表达升高以及预测的免疫逃逸潜力增高。单细胞分析提示SPP1相关信号可能有助于免疫微环境重塑。实验验证支持所选基因在胶质瘤细胞中的差异表达。
结论
该机械敏感基因特征与胶质瘤的免疫微环境异质性和生存相关。该模型可能提供补充性的分层信息，并支持进一步研究机械生物学相关的肿瘤-微环境相互作用。
机械敏感基因特征与胶质瘤免疫微环境及预后：一项多队列整合分析
胶质瘤是中枢神经系统中最常见且最致命的原发性恶性脑肿瘤，约占恶性脑肿瘤的80%。尽管手术、放疗和化疗等传统治疗手段不断进步，但由于胶质瘤的高度侵袭性和恶性特征，加之治疗选择有限，大多数患者的总体预后仍然较差，平均生存期仅为12至15个月，近80%的患者在诊断后第一年内死亡。除了肿瘤本身进展以外，癫痫持续状态等神经并发症也与脑肿瘤患者的功能衰退和高死亡率相关，凸显了肿瘤相关神经事件的更广泛临床负担。因此，改善分子风险分层并理解肿瘤-微环境相互作用至关重要。
胶质瘤复发和预后不良的主要原因之一是胶质瘤细胞向健康脑组织的浸润。胶质瘤细胞甚至可广泛扩散至对侧半球，使得这些侵袭性细胞难以通过手术根除。胶质瘤的侵袭受到肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中多种复杂因素的影响，其中包括机械应力。除了影响侵袭外，脑部微区域的机械异质性可能改变细胞转录程序，将细胞推向更具侵袭性的间充质表型。TME的生物力学特性还可通过影响代谢来调控胶质瘤的增殖、存活、迁移和药物反应。这表明胶质瘤的机械特性在疾病进展、免疫逃逸和治疗反应中发挥基本作用。然而，其潜在分子机制仅刚刚开始被揭示。因此，从机械力角度识别新的治疗靶点可能是发现胶质瘤新治疗策略的关键。
脑组织柔软且敏感，提供了低机械阻力的微环境。癌细胞可能通过内在遗传机制和外在微环境线索适应大脑的特定机械特性。既往研究报道，胶质瘤TME的机械模量随疾病进展而增加。尽管普遍认为胶质瘤比脑组织更硬，但胶质瘤不同区域的硬度差异显著，提示胶质瘤的不同区域可能具有不同的机械特性。此外，固体应力、间质液压力和细胞外基质（extracellular matrix, ECM）硬度影响肿瘤行为，使得在体外探索机械特性对胶质瘤的影响具有挑战性。目前该领域缺乏临床前研究，使用机械基因集模型进行分析可能是避免复杂混杂因素的重要途径。精准肿瘤学在解决胶质瘤检测问题方面具有很大潜力，但很少有研究系统分析机械力对肿瘤的影响。该方法可能有助于识别影响胶质瘤不良预后和免疫特征的关键机械信号，使其成为提高生存率的理想途径。
在这项研究中，研究人员建立了机械敏感九基因风险特征，并利用多个独立队列和单细胞转录组分析，系统评估了其与临床结局、免疫微环境、治疗反应和肿瘤-微环境相互作用的关联。
在对TCGA队列中691例胶质瘤样本、CGGA-301队列301例、CGGA-325队列324例以及GSE16011队列276例胶质瘤样本（均具有完整临床病理信息）进行分析后，研究人员从五个机械敏感基因集中提取了共399个机械敏感基因。通过单变量Cox回归和Kaplan-Meier（KM）分析，鉴定出292个与生存相关的机械敏感预后基因。基因本体论（Gene Ontology, GO）富集分析显示，这些基因主要富集于与机械刺激反应相关的生物学过程，包括机械刺激反应、机械刺激的感觉感知、声音的感觉感知、细胞对机械刺激的反应等，以及涉及机械感受细胞或器官发育的过程。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路分析提示这些基因与病毒和细菌感染及免疫相关信号通路相关。
为构建预后特征，研究人员对292个基因进行最小绝对收缩和选择算子（least absolute shrinkage and selection operator, LASSO）回归分析以避免过拟合，随后对LASSO回归返回的16个基因采用AIC方法的多元Cox回归分析，最终构建了包含9个基因（IGFBP2、TBX1、MYD88、TMPRSS3、PCDH15、BIRC5、TNFSF14、AQP1和BDKRB1）的最优模型。其中TBX1和PCDH15被鉴定为胶质瘤生存的保护因素，风险比（hazard ratio, HR）<1；而IGFBP2、MYD88、TMPRSS3、BIRC5、TNFSF14、AQP1和BDKRB1被鉴定为胶质瘤生存的风险因素，HR>1。基于这9个基因的表达水平及其相应的回归系数构建风险评分公式。根据中位风险评分将TCGA队列患者分为高风险组（n=345）和低风险组（n=346）。KM生存分析显示高风险组总生存率显著低于低风险组（p<0.0001）。时间依赖性受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线显示1年、3年和5年总生存期的曲线下面积（area under the curve, AUC）分别达到0.90、0.92和0.87。
为验证该预后特征的稳健性和可重复性，研究人员将TCGA队列的风险评分公式应用于CGGA-301、CGGA-325和GSE16011三个外部验证队列。在三个队列中均观察到一致结果：高风险组患者死亡风险显著高于低风险组（p<0.0001）。CGGA-301队列中1年、3年和5年OS的AUC分别为0.72、0.81和0.80；CGGA-325队列中分别为0.90、0.92和0.87；GSE16011队列中分别为0.80、0.88和0.85。这些发现证实了风险模型在三个独立外部队列中的可重复性。
进一步分析显示，机械敏感风险特征与胶质瘤患者的临床病理特征相关。在TCGA、CGGA-301、CGGA-325和GSE16011数据集中，GBM和LGG患者高风险组的OS均降低。风险评分在不同患者亚组间差异显著，高级别胶质瘤患者评分较高。在TCGA数据集中，1p/19q非联合缺失、IDH野生型和MGMT启动子未甲基化患者具有较高的风险评分，这与其他数据集的观察结果一致。
为评估该模型的独立预后价值和临床实用性，研究人员进行了单变量和多变量Cox回归分析。在TCGA数据库中，单变量和多变量分析均证明机械敏感风险评分与OS显著相关（HR=3.145，95%置信区间[confidence interval, CI: 2.758-3.587]；HR=2.330，95% CI: 1.860-2.910）。CGGA-301和CGGA-325数据集的验证结果也证实机械敏感风险评分是胶质瘤OS的可靠独立预后因素。研究人员基于九基因风险特征、WHO分级、年龄、性别、IDH突变状态和MGMT启动子甲基化状态构建了列线图以预测TCGA队列的1年、3年和5年OS。校准曲线显示预测生存时间与实际生存时间具有一致性，决策曲线分析（decision curve analysis, DCA）表明列线图在预测胶质瘤患者OS率方面表现良好。
鉴于KEGG分析提示机械刺激反应相关基因与免疫相关生物学过程相关，研究人员评估了不同风险组之间的免疫细胞浸润差异。在TCGA队列的22种免疫细胞亚型中，高风险组有9种亚型浸润水平显著较高，低风险组有7种亚型较高。值得注意的是，M0巨噬细胞、M1巨噬细胞和中性粒细胞在四个队列的高风险组中均表现出较高浸润水平，而初始CD4+ T细胞和活化NK细胞在四个队列的低风险组中均表现出较高浸润水平。这表明机械相关风险因素可能通过影响巨噬细胞极化或中性粒细胞活性促进肿瘤进展，而机械相关保护因素可能通过CD4+ T细胞和NK细胞抑制肿瘤进展。在免疫检查点分子（PDCD1、CD274和LAG3）和免疫抑制因子（IL10、TGFβ1、ARG1、VEGFA、CD70和IL6）的表达分析中，所有因子在高风险组中均表现出较高表达水平，提示高风险组与免疫抑制性肿瘤微环境相关。
通过肿瘤免疫功能障碍与排斥（Tumor Immune Dysfunction and Exclusion, TIDE）分析，研究人员发现TCGA队列中高风险组的TIDE评分和免疫排斥评分显著较高，而微卫星不稳定性（microsatellite instability, MSI）评分较低。CGGA-325队列中也观察到高风险组TIDE、免疫功能障碍和免疫排斥评分显著升高，MSI评分较低。这些发现提示高风险组患者具有更高的预测免疫逃逸潜能，可能与ICIs反应性降低相关。
药物敏感性分析显示，这九个基因与胶质瘤常用化疗药物之间存在差异性相关。高风险组对厄洛替尼、卡莫司汀、帕博西尼和长春新碱的IC50值较高，表明低风险组对这些药物更敏感；而高风险组对顺铂、伊立替康、瑞博西尼和替莫唑胺的IC50值较低，提示高风险组对这些药物更敏感。
在单细胞分析中，经过线粒体基因质量控制后共纳入37,090个细胞。基于CellMarker数据库的细胞标志物，研究人员将胶质瘤细胞分为六类：星形胶质细胞、小胶质细胞、癌症干细胞、少突胶质细胞、T细胞和巨噬细胞。IGFBP2主要在星形胶质细胞和癌症干细胞中表达；PCDH15和BIRC5主要在癌症干细胞中表达；AQP1主要在星形胶质细胞中表达。细胞通讯分析显示，分泌型磷蛋白1（secreted phosphoprotein 1, SPP1）-CD44和SPP1-(ITGAV+ITGB1)可能在胶质瘤中巨噬细胞、T细胞、小胶质细胞和癌症干细胞之间的细胞通讯中发挥关键作用。此外，Spearman相关分析显示风险评分与SPP1表达在TCGA（R=0.680, p<0.001）、CGGA-301（R=0.617, p<0.001）、CGGA-325（R=0.665, p<0.001）和GSE16011（R=0.620, p<0.001）四个队列中均呈显著正相关。
实验验证方面，研究人员通过qRT-PCR检测了人星形胶质细胞系NHA和胶质瘤细胞系U87、U251中九个机械刺激反应基因的RNA表达水平。结果显示，胶质瘤保护因素TBX1和PCDH15在U87和U251中表达确实低于NHA，而风险因素IGFBP2、MYD88、TMPRSS3、BIRC5、TNFSF14、AQP1和BDKRB1在U87和/或U251中表达高于NHA。通过人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas, HPA）数据库的蛋白表达验证中，MYD88在高级别胶质瘤和低级别胶质瘤中均比正常大脑皮层组织表达更高，BIRC5在高级别胶质瘤中比低级别胶质瘤和正常大脑皮层组织表达更高。
论文发表在《Neurological Research and Practice》。该研究通过整合多队列转录组数据、单细胞分析和实验验证，系统性地构建并验证了一个机械敏感九基因预后特征，为胶质瘤的分子风险分层提供了补充信息，并揭示了机械生物学与肿瘤免疫微环境之间的潜在联系。
