《Metabolomics》：Metabolic insights into the pathophysiology of tuberculous meningitis in FFPE postmortem human brain tissue
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中文摘要翻译：
背景：结核性脑膜炎（TBM）由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起，是肺外结核最严重的形式，具有高发病率和死亡率，尤其是在诊断延迟时。加深对TBM相关代谢改变的理解可能有助于开发新型诊断生物标志物，并为疾病病
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背景：结核性脑膜炎（TBM）由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起，是肺外结核最严重的形式，具有高发病率和死亡率，尤其是在诊断延迟时。加深对TBM相关代谢改变的理解可能有助于开发新型诊断生物标志物，并为疾病病理生理学提供见解。
方法：在本研究中，研究人员采用非靶向二维气相色谱-飞行时间质谱（GC×GC-TOFMS）代谢组学方法，对来自41例TBM病例和6例非TBM对照病例的36个组织切片的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）死后人脑组织进行分析。代谢组学数据经处理后，使用多变量和单变量统计方法进行归一化和分析，包括主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA），并采用变量重要性投影（VIP）评分。这些结果进一步与患者临床数据相关联。
结果：在TBM和对照组织之间观察到不同的代谢谱。TBM样本中多种代谢物显著减少，尤其是烷烃和烯烃类化合物，此外与醇类、脂肪酸、脂质、碳水化合物和氨基酸相关的代谢物也观察到进一步减少。这些代谢改变提示TBM受累脑组织中主要存在宿主赖氨酸降解通路（与犬尿氨酸通路相关）的显著扰动。
结论：总体而言，这些发现为终末期TBM的代谢景观提供了见解，并提示了可能参与疾病病理生理学的潜在代谢通路。在可获取的患者组织和生物体液中进一步研究这些代谢特征可能有助于生物标志物的开发，并为TBM的未来治疗策略提供信息。
论文解读文章
一、研究背景与问题
结核性脑膜炎（TBM）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）引起的严重中枢神经系统感染，是肺外结核最致命的形式。TBM的临床诊断极为困难，因其症状与其他脑膜炎相似，且脑脊液中的病原体载量极低，需要高灵敏度的检测工具。尽管已有最佳治疗，许多患者仍遗留永久性神经功能缺损或死亡。目前缺乏经验证的成人TBM早期诊断生物标志物，对疾病病理生理学的理解也尚不充分。组织病理学上，TBM区别于其他脑膜炎的主要特征是脑干和蛛网膜下腔中形成肉芽肿，但肉芽肿的组成和形成机制仍未阐明。鉴于疾病的严重性和现有诊断工具的不足，采用“组学”技术探索不同样本基质中的代谢改变，有助于揭示TBM的病理生理机制并发现新型生物标志物。然而，人脑组织的获取仅限于死后，且福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织的代谢组学研究面临标准化方案缺乏和代谢物降解等挑战。因此，本研究旨在利用高灵敏度的非靶向代谢组学技术，对TBM死后脑组织进行代谢特征分析，以揭示疾病相关的代谢通路改变。
二、研究设计与关键方法
研究人员从南非开普敦Tygerberg医院神经病理学档案中获取了1975年至2012年间收集的FFPE人脑组织样本，共77份样本，包括41例TBM死亡患者（具有完整肉芽肿）的组织块和6例非TBM对照患者的36个组织块（对照样本来自意外死亡且无脑感染的患者，其中部分对照存在先天异常、胎儿酒精综合征或缺血缺氧性脑损伤，因此归类为非TBM而非完全健康脑组织）。研究采用激光显微切割技术精准获取TBM样本中的肉芽肿区域和周围组织。代谢物提取采用极性溶剂（甲醇-水）和非极性溶剂（二氯甲烷-甲醇）分步提取，经肟化和硅烷化衍生后，使用二维气相色谱-飞行时间质谱（GC×GC-TOFMS）进行非靶向代谢组学分析。数据经内标归一化、50%过滤、log10转换和Pareto标度化后，采用主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）进行多变量统计分析，结合VIP值、倍数变化、t检验（FDR校正）和效应量筛选显著差异代谢物，并通过热图和去偏稀疏偏相关（DSPC）网络分析与临床数据的关联。
三、主要研究结果
3.1 代谢谱的整体分离
PCA和PLS-DA分析显示TBM与非TBM脑组织之间存在清晰的聚类和分离，PLS-DA模型的Q2和R2值分别为0.87和0.89，预测准确率达0.978，置换检验确认模型未过拟合。454种检测到的代谢物中有294种（VIP>1.0）导致两组间显著分离。
3.2 显著差异代谢物
共有41种代谢物在TBM组与非TBM组之间达到统计学显著差异（VIP>1.0，倍数变化>2.0，FDR p<0.05，效应量>0.8）。其中十种代谢物（包括(2Z,5Z)-2,5-十五碳二烯-1-醇、花生四烯酸、D-手性肌醇、4-酮葡萄糖、己醇、二十一酸甲酯、庚二酸、哌啶酸、孕烯醇酮和L-焦谷氨酸）在全部TBM病例中降至GC×GC-TOFMS检测限以下。整体上，TBM样本中烷烃和烯烃类、醇类、脂肪酸类、脂质类、碳水化合物类和氨基酸类代谢物均显著减少。
3.3 肉芽肿区域与周围组织的比较
在肉芽肿区域与周围组织的比较中，6种代谢物（三十三烷、二十三烷、17-三十五碳烯、二十四烷、3-十三碳烯和5-二十碳烯）达到统计学显著差异，全部属于烃类（烷烃和烯烃）。其中3-十三碳烯和5-二十碳烯在肉芽肿区域显著上调，而其余四种在周围组织中显著下调。但效应量较小（0.2-0.34），实际意义较低。
3.4 显著代谢物与临床信息的关联
相关分析和DSPC网络显示，富马酸与坏死区和非坏死区的Mtb杆菌数量、杆菌载量、脑重及小脑梗死呈正相关；二十二烷与脑/幕下/颅神经根肉芽肿、脑干梗死和小脑梗死呈正相关；2-苯乙醇与脑干梗死及脑/幕下/颅神经根肉芽肿呈正相关；辛二酸与入院时使用乙硫异烟胺呈显著正相关；油酸与最终TBM分期呈负相关，而粟粒性结核与最终TBM分期呈正相关。
3.5 通路层面的发现
研究揭示了赖氨酸降解通路（通过天冬氨酸途径生物合成）在TBM中的重要性。与该通路相关的代谢物（戊二酸、哌啶酸、哌啶、2-氧代己二酸和2-氧代戊二酸）均显著改变。此外，葡萄糖、D-手性肌醇、肌醇等糖类及醇类（如2,5-十五碳二烯-1-醇、己醇、2-苯乙醇等）在TBM中显著降低或低于检测限。
四、讨论与结论
研究人员在讨论中提出，Mtb可能通过分解烃类（烷烃和烯烃）获取能量，这与TBM中多种烃类显著减少的现象一致。Mtb还可能利用脂肪酸和脂质作为保护屏障和能量来源，因为其蜡质细胞壁主要由脂质构成，TBM中花生四烯酸、亚油酸、胆固醇、油酸等多种脂质显著降低，其中胆固醇浓度较非TBM降低超过百倍。此外，Mtb具有在缺氧环境中存活的能力，可能通过从脂肪酸中获取氧来维持代谢和复制。有机酸（如富马酸、甘油酸、戊二酸）的显著减少表明宿主严重能量耗竭。氨基酸（如哌啶酸和L-焦谷氨酸）的耗竭可能涉及谷胱甘肽代谢和氧化应激。研究还发现，虽然脑组织中未观察到犬尿氨酸通路的显著改变，但赖氨酸降解通路与犬尿氨酸通路存在关联，提示不同样本基质中的代谢通路可能不同但可相互联系。
研究结论指出，TBM脑组织中脂肪酸、醇类、烷烃、烯烃及赖氨酸降解通路代谢物的显著减少，与既往在尿液和脑脊液中TBM研究的结果一致，表明Mtb感染对宿主的影响在不同样本类型中具有一致性。本研究是首个对TBM死后脑组织进行非靶向代谢组学分析的研究，证明了利用存档FFPE组织进行代谢研究的可行性。尽管存在对照样本非完全健康、样本年龄跨度大、FFPE组织降解等局限性，但研究结果为TBM的病理生理学提供了新的代谢见解，并提示这些代谢特征可能作为晚期TBM的潜在线索，未来需在可获取的组织和生物体液中进一步验证，以促进生物标志物的开发和治疗策略的优化。该论文发表于《Metabolomics》杂志。
