膜破坏增强的蓝靛果（Lonicera caerulea L.）中精油与ε-聚赖氨酸协同抗菌作用以实现对腐败酵母的靶向抑制

《Foods》：Membrane-Disruption-Enhanced Synergistic Antimicrobial Action of Essential Oils and ε-Polylysine for Targeted Inhibition of Spoilage Yeasts in Blue Honeysuckle (Lonicera caerulea L.)

　　

蓝靛果在贮藏过程中的腐败主要由特定优势微生物引起，而大多数抗菌体系在开发时并未考虑这些目标腐败菌种。本研究从蓝靛果果实中分离出优势腐败酵母，并以这些酵母及常见食源性细菌作为目标菌株构建了抗菌体系。结果表明，该抗菌体系表现出显著的协同抗菌活性。进一步分析显示，精油破坏了细胞膜结构并增加了膜通透性，从而促进了ε-聚赖氨酸（ε-PL）与细胞内组分的相互作用。处理后检测到多种生理变化，包括膜去极化、细胞内组分泄漏、细胞内活性氧（ROS）积累以及细胞代谢抑制。这些观察结果表明，微生物细胞的损伤可能是由复合体系协同诱导的。将该体系应用于蓝靛果果实后可有效抑制内源性腐败微生物的生长，延缓贮藏期间品质劣变，并显著降低失重率和腐烂率以及颜色、花青素含量和维生素C（VC）含量的变化。这些结果表明，基于优势腐败微生物构建抗菌体系可提高保鲜效率，为蓝靛果及类似水果的贮藏提供了一种有效途径。

蓝靛果（Lonicera caerulea L.）是一种富含花青素及其他生物活性成分的浆果，具有显著的抗氧化、抗炎和抗菌等药用价值。然而，采后蓝靛果含水量高、代谢旺盛，极易受到微生物污染，导致软化、腐烂及营养品质的显著损失。研究表明，果实采后贮藏过程中的腐败主要由特定优势微生物的生长所驱动，而非整个微生物群落。蓝靛果中的优势腐败酵母被鉴定为果实劣变的关键贡献者，因此控制这些关键腐败微生物对提高蓝靛果的保鲜效率至关重要。

目前常用的水果保鲜策略主要依赖化学防腐剂和低温贮藏，但化学防腐剂存在潜在安全隐患和残留问题，而低温贮藏则需严格控制温度且可能引发冷害。近年来，天然抗菌剂作为更安全的替代品受到广泛关注，然而大多数现有抗菌体系均针对广谱抗菌活性设计，未考虑导致果实腐败的具体微生物，这种缺乏靶向性的抗菌设计往往导致保鲜效果不佳和抗菌剂利用效率低下。精油因其广谱活性和低毒性而被认为是极具潜力的天然抗菌物质，山鸡椒精油（Litsea cubeba essential oil, LCEO）和肉桂精油（cinnamon essential oil, CEO）均具有多样的生物活性，但精油水溶性差、挥发性高和不稳定性等限制了其实际应用。ε-聚赖氨酸（ε-polylysine, ε-PL）作为一种天然阳离子抗菌肽，主要通过与带负电的细胞表面发生静电相互作用发挥抗菌活性，但对某些腐败微生物单独使用可能无法达到足够的抗菌效果。将不同天然抗菌剂组合被认为是增强抗菌性能的有效策略，精油与ε-PL可能表现出互补机制：精油可破坏细胞膜结构并增加通透性，而ε-PL可在穿透细胞膜后与细胞内组分进一步相互作用。然而，精油与ε-PL之间的协同机制尚未被清楚阐明，特别是在蓝靛果等特定水果体系中靶向抑制优势腐败微生物的应用方面。

研究人员从蓝靛果浆果中分离出优势腐败酵母并作为目标菌株，构建了基于山鸡椒精油、肉桂精油和ε-PL的复合精油-聚赖氨酸（EOS-PL）抗菌体系。研究人员系统评价了EOS-PL的抗菌活性和协同效应，并重点从膜破坏和细胞内反应角度探究了其作用机制，同时评估了该体系在蓝靛果保鲜中的应用效果。研究结果表明，EOS-PL表现出显著协同抗菌活性，其机制涉及精油破坏细胞膜结构并增加通透性，从而促进ε-PL与细胞内组分的相互作用，导致膜去极化、胞内物质泄漏、活性氧积累和代谢抑制等多种生理改变。该体系应用于蓝靛果果实后有效抑制了内源腐败微生物的生长，延缓了贮藏期间品质劣变。该研究为开发水果采后靶向抗菌保鲜策略提供了理论依据和实验参考，相关论文发表于《Foods》期刊。

研究人员开展研究主要采用以下关键技术方法：从自然腐烂的蓝靛果果实中分离纯化优势腐败酵母，通过形态学观察和分子生物学鉴定构建系统发育树（样本采集自中国哈尔滨蓝靛果种植园）；采用微量肉汤稀释法测定单一抗菌剂、复合精油（EOS）和EOS-PL的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC），并通过棋盘稀释法计算分级抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration index, FICI）评价协同效应；利用扫描电子显微镜（SEM）观察细胞形态变化，通过DiBAC₄(3)荧光探针测定膜电位、DCFH-DA探针检测胞内活性氧（ROS）、SYTO-9/PI双染法评估膜完整性、相对电导率法测定膜通透性，通过紫外分光光度法检测蛋白质和核酸泄漏、试剂盒法测定碱性磷酸酶（AKP）活性和ATP渗出，并采用SDS-PAGE分析胞内蛋白变化；在蓝靛果保鲜应用实验中，将果实分为对照组、EOS组、PL组和EOS-PL组进行浸泡处理，定期测定外观色泽、失重率、腐烂率、pH、可溶性固形物（TSS）、花青素、总酚、维生素C（VC）、丙二醛（MDA）含量及微生物指标。

**3.1 腐败酵母的形态学与分子生物学鉴定**

从腐烂蓝靛果果实中分离出两株优势腐败酵母，经形态学观察和分子生物学鉴定确定为克鲁斯假丝酵母（C. krusei，编号BYkrnzF01）和胶红酵母（R. mucilaginosa，编号BYjhF01），为构建EOS-PL体系提供了明确的微生物靶标。

**3.2 EOS与ε-PL的协同抗菌效果**

单一抗菌剂的MIC测定结果显示，LCEO对R. mucilaginosa和E. coli的MIC均为0.500 mg/mL，表现出较强的抗菌活性；CEO对两株酵母菌具有较好的抑制效果；ε-PL对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和酵母菌的MIC为1.000–2.000 mg/mL。当LCEO与CEO以1:2比例复配时EOS抗菌活性最佳，对C. krusei、R. mucilaginosa、E. coli和S. aureus的MIC分别为0.250、0.125、0.125和0.500 mg/mL。当EOS（LCEO:CEO = 1:2）与ε-PL以2:1比例复配时，EOS-PL对四种菌株的MIC分别为0.125、0.063、0.063和0.125 mg/mL，均低于单独使用时的值。FICI结果显示，EOS:P L = 2:1时，EOS-PL对四种菌株的FICI值均不超过0.500，表明EOS与ε-PL之间存在显著协同抗菌作用，这归因于EOS的主要活性成分（肉桂醛和柠檬醛）破坏微生物细胞膜结构并增加通透性，从而促进ε-PL通过静电相互作用进入受损细胞。

**3.3 EOS-PL的抗菌活性**

生长曲线测定结果表明，对照组呈现典型的“S”型生长曲线。经1/2 MIC EOS-PL处理后，所有测试菌株的生长均受到抑制，对数期延迟约2–4 h。当EOS-PL浓度达到MIC和2 MIC时，OD₆₀₀随时间无明显变化，最大生物量较对照组显著降低（p < 0.05），表明微生物生长几乎被完全抑制。EOS-PL对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和酵母菌均表现出抑制作用，且效果与浓度正相关。

**3.4 EOS-PL的抗菌机制**

**3.4.1 EOS-PL对微生物形态的影响**

SEM观察显示，未处理的微生物细胞表面光滑、形态完整。经EOS-PL处理后，1/2 MIC浓度下细胞表面开始出现凹陷，MIC浓度下表面粗糙度增加、膜损伤加重，2 MIC浓度下细胞严重受损、出现大量孔洞并丧失正常形态，表明EOS-PL对微生物细胞造成严重的形态损伤。

**3.4.2 EOS-PL对细胞膜电位的影响**

DiBAC₄(3)荧光染色结果显示，经EOS-PL处理后四种测试菌株的荧光强度均高于对照组，且随浓度增加而增强，表明EOS-PL可诱导微生物细胞膜去极化。去极化的细胞膜无法有效发挥保护屏障功能，有利于EOS-PL穿透形成孔洞并导致胞内离子泄漏。

**3.4.3 EOS-PL对胞内ROS水平的影响**

DCFH-DA荧光探针检测结果显示，与对照组相比，随着EOS-PL浓度增加，四种测试菌株的胞内ROS含量逐渐升高，表明抗菌剂浓度的增加可能引发细胞更高的氧化应激水平，最终抑制微生物生长。

**3.4.4 EOS-PL对细胞膜完整性的影响**

SYTO-9/PI双荧光染色结果显示，未处理细胞仅呈现绿色荧光，表明膜功能完整。1/2 MIC浓度下同时出现红绿荧光，表明部分微生物细胞膜受损。MIC浓度下红色荧光占主导，2 MIC浓度下仅检测到红色荧光，证实细胞膜完整性完全丧失，损伤程度与抗菌剂浓度正相关。

**3.4.5 EOS-PL对细胞膜通透性的影响**

相对电导率测定结果显示，随时间延长所有样品的相对电导率均逐渐增加。EOS-PL处理组的相对电导率总体呈先快速上升后趋缓的趋势，且与浓度显著正相关（p < 0.05）。2 MIC浓度处理12 h后，C. krusei、R. mucilaginosa、E. coli和S. aureus的相对电导率分别达到65.37%、56.73%、46.03%和41.37%，较对照组显著升高，表明EOS-PL增加了细胞膜通透性并触发胞内离子逐渐泄漏。

**3.4.6 EOS-PL对胞内物质泄漏的影响**

经2 MIC EOS-PL处理后，四种菌株的OD₂₈₀和OD₂₆₀较对照组显著增加，表明蛋白质和核酸发生大量泄漏。胞外AKP酶活性显著升高，表明细胞壁受到损伤。ATP泄漏量随EOS-PL浓度增加而显著升高，表明线粒体功能受损。这些结果证实EOS-PL损害了细胞膜和细胞壁的完整性与通透性，触发胞内组分泄漏，损伤程度呈浓度依赖性。

**3.4.7 EOS-PL对胞内蛋白质的影响**

胞内蛋白含量测定和SDS-PAGE分析结果显示，与对照组相比，经EOS-PL处理后四种菌株的胞内蛋白含量显著降低，蛋白质条带数量和强度随浓度增加而减少。2 MIC浓度下大部分条带几乎消失，表明EOS-PL可抑制蛋白质合成、促进高分子量蛋白降解并改变蛋白表达谱，从而增强抗菌效果。

**3.5 EOS-PL在蓝靛果保鲜中的应用**

**3.5.1 EOS-PL对蓝靛果外观和色泽的影响**

对照组从4 d开始出现腐烂变质，EOS组和PL组在6 d出现褐变和霉斑，而EOS-PL组有效抑制了微生物污染，将果实货架期延长至8 d。8 d时EOS-PL组的色差值仅为0.93，显著低于对照组的2.32，表明EOS-PL处理更有效地抑制了氧化褐变，延缓了色泽劣变。

**3.5.2 EOS-PL对蓝靛果失重率和腐烂率的影响**

8 d时对照组失重率达17.89%，EOS组和PL组分别显著降低62.49%和47.18%，EOS-PL组显著降低75.29%（p < 0.05）。对照组腐烂率达78.33%，EOS组和PL组分别显著降低82.98%和57.45%，EOS-PL组显著降低89.36%（p < 0.05），表明EOS和ε-PL可在果实表面形成物理屏障，既防止有害菌感染又抑制水分流失和呼吸作用。

**3.5.3 EOS-PL对蓝靛果pH和TSS含量的影响**

贮藏期间各组pH均呈上升趋势，8 d时对照组pH升至3.83，而EOS-PL组仅为3.40，表明EOS-PL处理能更有效抑制贮藏期间果实的呼吸代谢。TSS含量总体呈先升后降趋势，8 d时EOS-PL组较对照组显著提高23.77%（p < 0.05），表明EOS-PL处理可通过抑制呼吸代谢减少营养损失。

**3.5.4 EOS-PL对蓝靛果花青素、总酚和VC含量的影响**

花青素和总酚含量均呈先升后降趋势。8 d时EOS-PL组花青素和总酚含量较对照组分别提高38.91%和125.99%，表明EOS-PL有效延缓了果实衰老。VC含量总体呈下降趋势，8 d时EOS-PL组VC含量达60.27 mg/100 g，显著高于对照组的43.38 mg/100 g（p < 0.05），表明EOS-PL可减缓VC等营养物质的流失。

**3.5.5 EOS-PL对蓝靛果MDA含量的影响**

8 d时对照组MDA含量迅速升至0.72 μmol/g，EOS组和PL组分别为0.42和0.51 μmol/g，而EOS-PL组仅为0.34 μmol/g，表明EOS-PL处理可激活氧化防御系统，抑制贮藏后期脂质过氧化，保持膜完整性并延缓果实衰老。

**3.5.6 EOS-PL对微生物指标的影响**

贮藏结束时，EOS-PL组细菌数为3.55 log CFU/g，霉菌和酵母数为3.20 log CFU/g，均显著低于对照组（6.95和6.13 log CFU/g）及其他处理组（p < 0.05），表明EOS-PL处理有效抑制了蓝靛果贮藏期间内源微生物的生长。

**结论**

研究结果表明，基于优势腐败微生物设计抗菌策略比采用通用广谱方法能更有效地保鲜蓝靛果果实。分离的腐败酵母C. krusei和R. mucilaginosa为构建基于山鸡椒精油、肉桂精油和ε-PL的EOS-PL体系提供了明确的微生物靶标。复合体系比单一组分表现出更强的抗菌活性，表明精油与ε-PL之间存在协同效应。该效应可能主要与精油引发的膜损伤有关，精油可提高细胞通透性并促进ε-PL与细胞内靶标相互作用，从而破坏膜完整性和细胞代谢。EOS-PL应用于蓝靛果果实进一步证实该靶向抗菌体系可有效抑制内源微生物生长、减少腐烂并延缓贮藏期间品质劣变，同时有助于维持色泽、花青素含量和VC含量等关键品质属性。本研究提出了一种针对腐败酵母的天然复合保鲜剂设计路线，EOS-PL复合体系在实验室条件下展现出保持蓝靛果采后品质的良好潜力。然而，该体系在工业应用前仍需进行大规模商业化贮藏验证、递送载体优化和系统性安全评价。本研究结果为开发浆果类水果靶向天然保鲜策略提供了初步实验室参考。