《International Journal of Molecular Sciences》：Single-Cell and Spatial Omics Technologies in Rice Abiotic Stress Biology: A Methodological Review
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非生物胁迫——干旱、盐渍、极端温度、洪涝及重金属毒害——在全球范围内制约着水稻（Oryza sativa L.）产量，其潜在细胞程序在不同细胞类型间呈不均一分布，而批量组织检测手段往往将其平均化。本综述从方法学视角系统阐述了单细胞与空间组学技术在解析水稻非生物
非生物胁迫——干旱、盐渍、极端温度、洪涝及重金属毒害——在全球范围内制约着水稻（Oryza sativa L.）产量，其潜在细胞程序在不同细胞类型间呈不均一分布，而批量组织检测手段往往将其平均化。本综述从方法学视角系统阐述了单细胞与空间组学技术在解析水稻非生物胁迫生物学中的能力与局限。首先界定了模态空间：单细胞组学可在单个细胞或细胞核水平检测RNA、染色质可及性、DNA甲基化、蛋白质或代谢物特征，而空间组学则在保留组织空间坐标的前提下测量上述特征；二者互为补充而非相互替代。随后采用统一模板对各类技术平台——基于液滴的单细胞RNA测序（scRNA-seq）、包含SPLiT-seq在内的组合索引法、基于细胞核的单核RNA测序（snRNA-seq）及多组学联合检测、测序型与成像型空间转录组学——进行了评述，涵盖检测原理、可解答的科学问题、在水稻组织中的适用性、主要偏倚及无法支持的推断类型。为实现异质性文献中证据强度的可比性，全文采用四级证据体系：A级，源自水稻的直接细胞分辨率或空间证据，且经功能或田间验证；B级，水稻中稳健的功能与定位证据但缺乏单细胞数据支撑；C级，细胞分辨率证据但未经因果验证；D级，跨物种类比或理论构想。该体系的应用表明，水稻育种中具有实质应用价值的基因——SUB1A、OsHKT1;5、OsHMA3、OsNRAMP5、DRO1——均基于经典遗传学与田间试验的B级证据；而最高分辨率的细胞证据集中于根外层与屏障形成的C级层面；尽管高温与低温胁迫是导致减产的主导因素，水稻中却几乎完全缺乏相关细胞分辨率数据。除转录组外，本综述还探讨了单细胞DNA甲基化图谱、空间蛋白质组学与代谢组学及厚组织三维分析，明确区分了植物中已证实的技术能力与仅在哺乳动物中实现的检测手段，并评估了人工智能在注释、分割、批次校正、整合及扰动预测中的日益重要作用及其已知失效模式。通过对水稻、玉米与小麦的比较，提炼出可迁移的方法学策略。当前细胞分辨率组学已提升了生物学解释力与候选基因筛选效率，但其能否带来增量育种优势仍是有待验证的核心命题。
1. 引言
水稻（Oryza sativa L.）是全球半数以上人口的主粮作物，其产量对气候变化、土壤退化及极端天气表现出高度敏感性。长期观测数据显示，生长季最低温度每升高1°C，稻谷产量约下降10%，多种模型预测亦支持全球水稻产量随升温呈线性递减趋势。植物对非生物胁迫的响应并非全株均一过程，根表皮、外皮层、内皮层、维管薄壁细胞、叶肉细胞、保卫细胞及花药绒毡层在胁迫信号的感知、转导与执行中存在显著差异。批量转录组、蛋白质组及代谢组学虽已鉴定出OsHKT1;5/SKC1、SUB1A等关键抗逆基因，但因无法区分细胞类型，掩盖了低丰度信号并难以解析特定细胞的响应时空特征。本综述明确定义了核心术语：单细胞组学指通过物理分离或条形码标记在单个细胞或细胞核水平检测分子特征，空间组学则强调在组织原位保留空间坐标信息。二者属正交属性而非同一维度的技术梯度。基于此，综述聚焦于水稻单细胞与空间转录组学这一成熟领域，同时延伸至染色质可及性、单细胞DNA甲基化、蛋白质组及代谢组等新兴模态，始终关注各技术方法的实证边界及其与育种应用的衔接逻辑。为解决跨研究证据可比性问题，全文采用四级证据体系，旨在纠正“最高细胞分辨率等同于最接近应用”的认知偏差。近年来，scRNA-seq、snRNA-seq、多组学联合检测、scATAC-seq及空间转录组学等技术已在拟南芥、水稻、玉米等植物中广泛应用，水稻领域已形成根根尖图谱、多组织多胁迫图谱、水分胁迫下基因调控网络分析及多器官多组学图谱等里程碑式成果，为后续方法学评述奠定了数据基础。
2. 技术平台：检测原理、适用性与推断局限
各技术平台的差异体现在四个核心维度：细胞身份分辨率、组织位置保留能力、分子层检测广度及可负担的样本量与重复数。基于液滴的scRNA-seq通过酶解离获得原生质体并进行微流控分选，具有高通量与流程成熟的优点，但存在空间信息丢失、解离诱导人为胁迫及细胞类型回收偏倚等问题，尤其不适用于木质化组织或田间样本。组合索引法（如SPLiT-seq）通过多轮原位条形码标记替代物理分隔，显著降低了单样本成本并支持多样本并行处理，适合开展多基因型、多胁迫梯度的比较研究，但代价是单细胞核转录本检出深度下降及对稀有转录因子的检测效力减弱。板基全长转录组建模（如Smart-seq2）虽通量有限，但可实现异构体与等位基因特异性表达分析，在解析胁迫应答可变剪切机制中具有不可替代性。单核测序（snRNA-seq）与多组学联合检测（multiome）通过机械匀浆提取细胞核，避免了酶解离带来的胁迫干扰，更适合冷胁迫及冷冻样本分析，并能同步检测染色质可及性与转录组，但其核转录组富含内含子未剪接的前体RNA，对细胞质稳定转录本的覆盖度较低，且染色质开放状态仅反映调控潜力而非转录活性。空间转录组学分为测序型与成像型两类：测序型平台（如Stereo-seq、Visium）通过空间条形码捕获组织切片中的转录本，其分辨率取决于捕获单元尺寸与组织解剖结构的匹配度，在水稻根中需依赖匹配的单细胞参考数据进行去卷积分析以提升细胞层级的定位精度；成像型平台（如MERFISH、seqFISH+）可实现亚细胞水平的单分子分辨率，但受限于植物细胞壁穿透障碍、自荧光干扰及大液泡导致的胞质挤压效应，目前在水稻中仍处于技术验证阶段，适用于候选基因的定位确证而非无偏发现。数据分析流程中的统计复制单元选择（细胞水平vs伪 bulk水平）及细胞类型注释依赖参考标记基因等关键环节，是推断偏倚的主要来源，需警惕低重复设计导致的假阳性风险。
3. 水稻细胞类型图谱作为参考坐标系
细胞类型图谱将器官水平的表达变化锚定至特定细胞群、发育轨迹及调控网络中，构成了胁迫响应解析的基准框架。水稻根尖图谱已解析出9种主要细胞类型并配对染色质可及性数据，成功捕获了多层皮层与溶生性通气组织等水稻特有解剖特征，为盐分外排、屏障形成及重金属转运等过程的细胞定位提供了坐标；但其局限性在于样本多源于水培幼苗根尖，缺乏对成熟区、冠根、侧根及土壤栽培条件下的覆盖。叶片与幼苗图谱涵盖了15种叶细胞与9种根细胞类型，并纳入了NaCl与低氮胁迫处理，是现有规模最大的水稻胁迫单细胞资源，但保卫细胞等低丰度表皮类型回收不足，且缺乏生殖期高温与干旱处理的对应数据。花序、花药及雌蕊图谱虽已解析出小穗分生组织、绒毡层发育轨迹等细胞类型，但尚未纳入任何胁迫处理，导致生殖期高温胁迫这一主导产量损失因子缺乏细胞分辨率证据。胚与种子图谱结合Stereo-seq技术构建了萌发过程的时空图谱，鉴定出两种新型盾片细胞类型，为低温与盐渍条件下直播萌发力研究提供了基础。2025年发布的多器官多组学图谱整合了8个器官的116,564个细胞，通过细胞类型特异性染色质可及性与GWAS信号的交集分析，建立了细胞类型-农艺性状关联网络。跨物种比较显示，玉米在单细胞核技术及热胁迫响应细胞定位（皮层为主要响应类型）方面较为领先，小麦因异源六倍体基因组复杂性而侧重单核策略与同源基因不对称表达分析，其方法学经验可为水稻籼粳亚种间及野生近缘种的研究提供借鉴。总体而言，现有图谱在根尖端覆盖最密集，但与育种优先级呈倒置关系：生殖期器官与成熟根组织的细胞分辨率数据严重匮乏。
4. 胁迫生物学作为方法学案例研究
盐胁迫中，OsHKT1;5/SKC1（木质部Na+逆向转运）、OsSOS1（质膜Na+外排）及内皮层/外皮层栓化屏障构成核心响应模块，其中OsHKT1;5的细胞定位基于启动子报告系统（B级证据），缺乏水稻单细胞层面的直接验证。干旱与ABA信号通路中，ABA在韧皮部伴胞合成，外皮层与内皮层在MYB与NAC转录因子调控下构建栓化屏障，空间转录组学显示土壤压实胁迫下ABA合成基因与屏障基因呈现径向共定位模式，但激素示踪与扰动实验的缺失使得“ABA径向运输”仍为推论（C级证据）。DRO1基因通过调控根构型影响抗旱性，已获田间验证（B级证据）。高温胁迫下，根皮层与花药绒毡层是关键敏感组织，已克隆的TT1、TT2、TT3及qHTSF4.1等位点均为B级证据，水稻根尖scATAC-seq显示皮层染色质可及性变化最为显著（C级证据），与玉米根热胁迫转录组结果存在趋同，但跨物种保守性仍需验证。生殖期花药单细胞研究的空白是当前最大技术缺口。低温胁迫中，ICE–CBF/DREB–COR通路核心基因（COLD1、HAN1、bZIP73、CTB4a）均为B级证据，缺乏细胞分辨率数据，而snRNA-seq结合冷冻取样是规避酶解离温度干扰的理想方案。洪涝与低氧胁迫中，SUB1A介导的静止策略已通过大规模田间验证（B级证据），单细胞数据揭示了皮层通气组织形成的细胞周期抑制与细胞死亡执行程序（C级证据），证明细胞分辨率技术并非育种成功的先决条件，而是针对难定位靶点的加速工具。重金属胁迫中，OsNRAMP5、OsHMA3、OsLsi1/2等转运蛋白的细胞类型定位主要依赖免疫定位与突变体表型（B级证据），单细胞数据主要用于精细化已知转运网络的图谱，节点谷粒Cd装载组织仍缺乏细胞分辨率解析。综合来看，根外层（表皮、外皮层、内皮层）在多种胁迫下均表现出显著的转录响应，涉及细胞壁重塑、转运蛋白调控、渗透调节与ROS清除等保守模块，但需注意采样偏倚（根尖过度代表）与解离胁迫伪影的潜在混淆。证据层级与育种价值呈近似负相关：已转化的基因均基于B级经典遗传学证据，而最高分辨率的屏障程序研究仍停留在C级描述阶段。
5. 空间组学：从二维切片到厚组织分析
空间组学恢复了组织位置信息，为靶向干预提供了精准坐标。水稻中已验证的直接证据包括土壤压实胁迫下ABA合成的韧皮部定位与屏障基因的皮层诱导（C级证据），以及旱稻根中外层细胞HMGB1富集的空间差异（C级证据）。跨品种空间比较虽能筛选适应性分化基因，但因遗传背景混杂，仍需近等基因系与功能验证才能确立因果关系。细胞通讯与局部微环境解析在稻瘟病侵染研究中显示出单细胞相较于bulk数据的独特优势（75%差异基因仅在单细胞水平检出），但该结论尚不能直接外推至非生物胁迫。尚未开展但技术上可行的方向包括：空间转录组与元素成像联用以定位Na+或Cd的径向滞留位点、维管装卸过程解析、保卫细胞微环境响应及花药绒毡层高温响应图谱。三维空间组学面临三大路径挑战：连续切片重建受限于切片变形与配准误差，目前尚无水稻应用实例；组织透明化结合原位成像（如ClearSee、膨胀显微镜）适用于少量候选基因的三维验证，但通量受限；真三维原位转录组技术（如STARmap）在植物中受限于细胞壁穿透障碍与自荧光累积，尚未实现突破。当前水稻厚组织空间组学仍处于技术储备期，需解决细胞壁屏障与信号衰减等瓶颈。
6. 超越转录组的多组学整合
转录组与染色质可及性的多组学整合（multiome）是最成熟的技术组合，可将表达变化关联至顺式调控元件，但染色质开放仅指示调控潜力，无法直接推断表型因果。单细胞DNA甲基化组在植物中尚未实现技术突破，哺乳动物中建立的scBS-seq、sn-methylcytosine seq等方法受限于植物细胞解离难度与低DNA投入量，使得逆境胁迫表观遗传记忆的细胞分辨率解析成为悬而未决的问题。单细胞蛋白质组学受限于植物细胞壁阻碍与皮克级蛋白含量，目前仅处于概念验证阶段；空间代谢组学（质谱成像）已在大麦根盐胁迫研究中实现区域水平的代谢物与脂质定位，为水稻提供了可借鉴的技术路线。遗传与表型整合层面，细胞类型特异性eQTL与GWAS区间染色质可及性交集分析，可将数量性状位点（QTL）锚定至特定细胞类型，但每一步推断（可及→差异表达→因果）均需独立实验验证。多组学证据链的强度差异显著：转录组与染色质数据在水稻中已有直接验证，蛋白质组与甲基化组主要依赖其他物种类推，而单细胞分辨率下的这些模态在水稻中仍属理论构想。
7. 转化意义
单细胞图谱当前最切实的贡献是候选基因优先级排序。在GWAS或QTL区间内，结合细胞类型特异性可筛选出位于韧皮部薄壁细胞（离子转运）、外皮层（屏障形成）或绒毡层（花粉活力）等机制合理部位的候选基因，有效弥补功能注释不足的缺陷。OsLTPL120因根表皮特异性表达被提名并通过突变体验证，证明了该逻辑的可行性，但仍需系统性比较细胞类型驱动与注释驱动的筛选效率。细胞类型信息亦有助于解析已克隆位点的作用机制（如OsHKT1;5的木质部定位解释其Na+外排功能），并指导表型鉴定策略（如聚焦外皮层栓化沉积等细胞层近端性状）。转化 readiness矩阵显示：已部署的基因（SUB1A、OsHKT1;5、OsHMA3、OsNRAMP5、DRO1）均基于经典遗传学验证；细胞定位明确但待验证的候选基因包括HMGB1与外皮层MYB/NAC模块；细胞类型特异性启动子、顺式调控编辑及GRN引导的基因叠加仍属方法学提案。细胞类型加权基因组预测是值得检验的统计假设，但尚无证据表明其在水稻胁迫性状预测中优于标准模型。
8. 挑战与未来方向
实验室胁迫与田间胁迫存在本质差异：后者具有渐进性、复合性及时空异质性，且作用于产量决定期（生殖期），而现有数据多源于幼苗期急性胁迫。参考基因组（多为粳稻）与育种材料（籼稻、地方品种）间的调控元件多样性导致注释不可直接迁移。相关性研究与因果性需求间的鸿沟需通过植物适配的Perturb-seq或CROP-seq技术填补，将候选基因转化为育种材料。技术成本限制了多基因型、多时间点与重复设计，组合索引法是提升实验广度的最优解。领域缺乏统一的细胞类型命名规范与分析标准，且单细胞数据进入育种管道的门槛极高，需满足效应量可检测、无负面连锁累赘及可编辑/标记等硬性指标。构建统一的水稻单细胞多组学胁迫图谱是迫切需求，需整合现有分散的资源，建立标准化细胞本体论与元数据框架。超越转录组的模态拓展（甲基化、蛋白质组、三维空间组）仍面临细胞壁、自荧光与低输入量的共性挑战。人工智能在细胞注释、图像分割、批次校正及多组学整合中展现出潜力，但需警惕哺乳动物预训练偏倚、批次校正过度消除生物学差异、黑箱推断不可解释及参考图谱覆盖偏差等失效模式，所有AI输出均需独立实验验证并与简单基线模型比较。
9. 结论与展望
单细胞与空间组学已为水稻提供了可用的器官细胞类型参考，解析了土壤压实下ABA径向信号、热胁迫染色质重塑及干旱下栓化屏障调控等细胞分辨率机制，并实现了跨品种空间比较与GWAS-细胞类型关联分析。然而，核心不对称性依然突出：育种转化成功的基因均基于B级经典证据且无单细胞数据支撑，而最高分辨率的细胞研究仍缺乏因果验证；主导产量损失的温冷胁迫及花药热响应机制几乎无细胞分辨率数据。未来进展不依赖于更大规模的图谱，而在于更优的实验设计：多基因型对照、渐变复合胁迫、生殖期取样、充足生物学重复（借助组合索引法）及系统的功能验证。互补组学层需用于确证转录组发现，人工智能应限于注释与整合等已验证任务，所有生物学主张均需独立验证。当前细胞分辨率组学主要提升了生物学解释力与候选筛选效率，其能否带来增量育种优势——即通过该技术获得田间验证的候选基因或优于标准模型的预测效能——仍是未来十年衡量该技术价值的核心标尺。
