HMOX1的异质性CRISPR/Cas9编辑与鸡LMH细胞中血红素-胆绿素代谢改变及基础应激相关转录程序有关

《International Journal of Molecular Sciences》：Heterogeneous CRISPR/Cas9 Editing of HMOX1 Is Associated with Altered Heme–Biliverdin Metabolism and Basal Stress-Associated Transcriptional Programs in Chicken LMH Cells

　　

由HMOX1编码的血红素氧合酶-1 (HO-1)催化血红素降解的限速步骤，生成胆绿素、一氧化碳和亚铁离子，从而将血红素周转与氧化还原调节及应激相关信号联系起来。在鸟类中，胆绿素作为主要血红素衍生产物被保留，但HMOX1扰动的细胞后果尚未充分阐明。在此，研究人员利用CRISPR/Cas9介导的编辑在鸡肝细胞癌细胞来源细胞中产生了异质性HMOX1编辑群体。选择的sgRNA将HO-1蛋白丰度降低约47%，且在检查的七个预测高风险脱靶位点未观察到可检测的切割。与载体对照细胞相比，HMOX1编辑细胞表现出细胞内血红素积累、胆绿素水平降低、氧化敏感荧光增强以及CCK-8吸光度值降低，表明血红素-胆绿素代谢和氧化还原稳态被破坏。RNA测序鉴定出2650个差异表达基因，包括951个上调基因和1699个下调基因。下调基因主要富集于免疫、细胞因子、MAPK/应激和细胞外信号相关通路，而DNA复制和细胞周期相关基因增加。富集项关联分析和STRING功能关联分析进一步鉴定出一个涉及IL1B、JUN、NFKBIA、IRF1、TGFB1、IL10、CCL5和PTGS2的协调模块。独立的RT-qPCR分析证实了选定的表达趋势。这些发现表明，异质性HMOX1编辑和HO-1丰度降低与鸡肝细胞癌细胞来源细胞中禽类血红素-胆绿素代谢轴的破坏以及基础免疫、应激、细胞外信号和细胞周期相关转录程序的协调重塑有关。

**研究背景、问题与目的**
血红素氧合酶-1 (HO-1，由HMOX1编码)催化血红素降解的限速步骤，生成胆绿素、一氧化碳和亚铁离子，从而将血红素周转与氧化还原调节及应激信号联系起来。在哺乳动物中，HO-1是充分表征的应激诱导基因，参与氧化应激、铁稳态、炎症调节和细胞存活。然而，鸟类具有独特的血红素分解代谢特征：多数鸟类胆绿素还原酶活性极低或缺失，使胆绿素作为主要血红素代谢产物和胆汁色素积累。先前研究在蓝绿色蛋壳色素沉积背景下探讨了HMOX1表达与胆绿素转运的关联，但未直接定义HMOX1如何影响禽类细胞内的血红素-胆绿素平衡。禽类HMOX1的功能研究相对有限，多集中于基因克隆、启动子结构或作为Nrf2/HO-1轴组分在氧化损伤、重金属暴露等模型中的表达变化，缺乏对HMOX1直接扰动后细胞后果的明确界定。因此，研究人员提出：HMOX1/HO-1功能改变不仅影响胆绿素生成，还可能改变细胞内氧化还原状态和下游转录响应。为验证这一假设，研究人员利用CRISPR/Cas9编辑在鸡肝细胞癌细胞来源的LMH细胞中建立部分HMOX1破坏模型，结合代谢测定、CCK-8还原代谢活性评估、DCFH-DA氧化敏感荧光测量和RNA-seq，评估HMOX1编辑对血红素-胆绿素代谢及应激相关转录响应的影响。该研究旨在为HMOX1在禽类血红素代谢中的作用提供细胞证据，并建立理解HMOX1扰动如何影响鸡细胞氧化还原和免疫相关分子程序的框架。论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》。

**关键方法概述**
研究人员使用CRISPR/Cas9系统，通过PX458骨架构建靶向HMOX1外显子3的sgRNA2表达载体，转染LMH细胞后经流式分选获得GFP阳性异质性编辑群体（ED组），以空载体转染细胞为对照（VC组）。采用T7核酸内切酶I检测7个预测脱靶位点，鸡特异性ELISA定量HO-1蛋白丰度。代谢与功能测定包括：血红素测定试剂盒（基于TMB氧化）检测胞内血红素，胆绿素提取后670 nm吸光度测定，CCK-8法评估还原代谢活性，DCFH-DA探针检测氧化敏感荧光。转录组分析采用RNA-seq（Illumina NovaSeq 6000），差异表达基因筛选标准为|log₂(Fold change)|≥1且FDR<0.05，并进行GO、KEGG富集、GSEA以及STRING/MCODE网络分析，RT-qPCR独立验证（以ACTB为内参）。实验分为系列A（3个生物学重复用于RNA-seq和HO-1蛋白定量）和系列B（4个生物学重复用于代谢和功能测定，其中3个另用于RT-qPCR）。

**研究结果**
**2.1 异质性HMOX1编辑产生多种移码等位基因并降低LMH细胞中HO-1蛋白丰度**
通过TA克隆和测序，sgRNA2在初始筛选群体中鉴定出6种缺失等位基因（DE1–DE6，缺失1–53 bp），均导致移码突变。概念翻译显示六种推断产物长度分别为149、110、105、107、132和93个氨基酸，均缺失天然催化残基Asp143及C端区域（第231–264位氨基酸）。AlphaFold 3预测结构显示编辑等位基因产物显著缩短，失去天然催化与C端结构域。T7E1检测显示在7个预测脱靶位点未检测到可切割产物。ELISA定量显示ED组HO-1蛋白丰度较VC组降低约47.0%（p<0.01，n=3），低于克隆水平Indel频率（69.0%），与异质性群体中含未编辑等位基因和多种编辑等位基因一致。

**2.2 HMOX1编辑改变血红素代谢、细胞氧化还原状态和CCK-8活性**
与VC细胞相比，ED细胞胞内血红素水平显著升高约48.5%（p<0.001，n=4），胞内胆绿素水平降低约31.9%（p<0.01，n=4），呈现血红素增加与胆绿素减少的互逆关系，符合HO-1依赖的血红素降解减弱。CCK-8测定显示ED细胞在6–48 h内OD450值持续低于VC细胞，且24 h后差异更明显（n=4），表明细胞还原代谢活性降低。DCFH-DA染色显示ED细胞荧光信号更强，定量分析证实氧化敏感荧光显著增加（p<0.01，n=4），表明胞内氧化状态升高。

**2.3 HMOX1编辑与LMH细胞中基础免疫、应激和细胞周期相关转录程序的协调重塑相关**
RNA-seq主成分分析显示ED与VC组转录谱分离。差异表达分析鉴定出2650个DEGs（951个上调，1699个下调）。功能富集显示下调基因主要富集于免疫与炎症调节、细胞因子介导信号、MAPK/应激、细胞外基质相互作用及细胞命运调控等通路（如Toll样受体信号、C型凝集素受体信号、MAPK信号、黏着斑、ECM-受体相互作用）；上调基因富集于DNA复制和细胞周期相关过程（如MCM2-7复合物、ORC、GINS、CDC45、PCNA、CCNE1/2等）。GSEA进一步证实MAPK信号、细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路在ED细胞中负富集，核心基因包括IL1B、IRF1、JUN、NFKBIA等。RT-qPCR独立验证显示IRF1、JUN、NFKBIA、PTGS2在ED细胞中显著下调，PCNA和MCM2显著上调（p<0.05或p<0.01），与RNA-seq一致；IL1B在ED细胞中未检测到扩增（Ct值未获得），支持其显著下调。STRING功能关联分析识别出包含HMOX1、IL1B、JUN、NFKBIA、TGFB1、IL10、SRC、PTGS2、CCL5的互作模块，MCODE进一步提取出包含HMOX1、NFKBIA、IL10、CCL5、IRF7、IL1B、JUN、IRF1、TGFB1、PTGS2的紧密连接子网络，提示HMOX1与免疫和应激调控基因存在功能关联。

**讨论与结论**
讨论部分指出，异质性HMOX1编辑使HO-1蛋白丰度降低约47%，导致胞内血红素积累、胆绿素减少、氧化敏感荧光升高及CCK-8还原代谢活性下降，表明HO-1介导的血红素降解减弱。在禽类中，胆绿素作为主要血红素代谢产物且抗氧化潜力，其减少可能进一步影响氧化还原状态。转录组中免疫、应激、细胞外信号相关基因的协调抑制与DNA复制/细胞周期基因的上调，提示HO-1减少可能触发一种补偿性复制应激反应，但CCK-8活性降低表明复制相关转录激活未转化为净增殖能力提升。富集网络和STRING分析揭示IL1B、JUN、NFKBIA、IRF1、TGFB1、IL10、CCL5和PTGS2构成的协调模块，将血红素代谢、氧化还原平衡与炎症信号联系起来。研究结论（翻译自原文第5节）：本研究在鸡LMH细胞中建立了异质性CRISPR/Cas9介导的HMOX1编辑细胞群体，并显示HO-1蛋白丰度降低伴随着血红素-胆绿素代谢稳态的破坏。HMOX1编辑细胞表现出胞内血红素积累、胆绿素水平降低、氧化敏感荧光增强以及CCK-8还原代谢活性下降，表明HO-1丰度降低与禽类血红素-胆绿素轴和细胞氧化还原状态的改变相关。转录组分析进一步揭示了基础转录谱的协调重塑，其特征为免疫、应激、细胞因子和细胞外信号相关程序的抑制，以及选定的DNA复制和细胞周期相关基因表达增加。富集项关联和STRING功能关联分析鉴定出一个涉及IL1B、JUN、NFKBIA、IRF1、TGFB1、IL10、CCL5和PTGS2的协调模块。总之，这些发现表明HO-1不仅有助于血红素降解和胆绿素生成，还在鸡肝细胞中维持氧化还原相关和基础转录稳态中发挥作用。