一种含有前药纳米颗粒的低交联水凝胶可通过调节神经炎症和细胞外基质沉积来促进脊髓再生

《Biomaterials》：A low-crosslinking hydrogel integrating prodrug nanoparticles modulates neuroinflammation and ECM deposition for enhanced spinal cord regeneration

　　

摘要

脊髓损伤会导致病理性细胞外基质沉积和组织硬化，从而阻碍轴突再生并打破生理平衡。Galardin可通过抑制基质金属蛋白酶来减少细胞外基质沉积并促进恢复，但全身给药无法有效改善局部微环境恶化状况。因此我们探索了一种通过调控水凝胶矩阵交联度来实现局部生物材料递送的策略，因为高交联密度的水凝胶会通过Piezo1激活以及Wwtr1依赖性的巨噬细胞重编程加剧神经炎症。基于此，我们设计了一种集成治疗平台，将pH响应型姜黄素琥珀酸自组装前药纳米颗粒（同时载有Galardin和碱性成纤维细胞生长因子，简称CrS-GF NPs）封装在低交联密度水凝胶中。通过在小鼠压缩性脊髓损伤模型中的大量测试，LCGH@CrS-GF系统不仅能调节过度的细胞外基质沉积和神经炎症，还能提供足够的神经营养支持，从而协同促进轴突再生和受损脊髓的功能恢复。我们的研究强调了使用具有特定交联密度的水凝胶来递送治疗药物的重要性，这类水凝胶可通过激发有益的生物反应并调控细胞外基质沉积来修复脊髓损伤。

引言

脊髓损伤会导致永久性的感觉和运动功能缺陷，目前尚无有效的临床治疗方法。脊髓损伤的病理机制是一个复杂的多阶段过程：在急性期，小胶质细胞和星形胶质细胞被激活，进而招募免疫细胞并促使炎症细胞因子及基质金属蛋白酶释放，最终导致细胞外基质降解紊乱[1]。在亚急性和慢性阶段，则会出现渐进性的囊状空洞形成以及两种类型的瘢痕组织，即星形胶质细胞瘢痕和纤维化细胞外基质沉积[2]、[3]，这些共同构成了阻碍轴突再生的强大屏障[4]。

细胞外基质是由蛋白聚糖、糖胺聚糖、胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白等大分子构成的高度动态网络，为细胞功能提供重要的生化与结构支撑[5]。细胞外基质形态结构和生化成分的变化会显著改变细胞微环境[6]。越来越多的证据表明，细胞与细胞外基质的相互作用会产生牵引力，进而影响细胞骨架张力和细胞形态[7]。这些机械信号会激活下游信号通路，调控细胞的黏附、迁移、增殖、分化以及组织再生等关键过程[8]、[9]、[10]。除了生化成分外，细胞外基质的物理性质，尤其是由于其成分沉积而导致的硬度变化，也越来越被视为影响细胞行为的重要因素[7]、[11]、[12]。在心脏疾病、肝脏疾病、组织纤维化以及癌症等多种病症中，都能观察到细胞外基质机械性质的病理性改变[13]、[14]、[15]、[16]。此外，升高的细胞外基质硬度还会通过调控与机械作用相关的细胞信号通路，进一步加剧纤维化进程和炎症反应[17]、[18]。然而在脊髓损伤背景下，细胞外基质成分沉积的具体作用和影响仍不明确。基质金属蛋白酶与细胞外基质稳态密切相关，有证据表明，过度活化的基质金属蛋白酶反而会在脊髓损伤后推动病理性细胞外基质积累。例如，中性粒细胞释放的基质金属蛋白酶会将NG2切割为其活性形式，直接促进纤维化瘢痕形成[19]。细胞外基质网络的形成取决于基质金属蛋白酶与组织金属蛋白酶抑制剂之间的平衡，当基质金属蛋白酶的过度活化超出组织金属蛋白酶抑制剂的调控能力时，细胞外基质稳态就会从有序的重塑转变为病理性沉积[1]。而且，MMP7介导的机械转导作用可以调控成纤维细胞的排列和细胞外基质沉积，这进一步证明了基质金属蛋白酶在脊髓损伤纤维化过程中的关键作用[20]。

在本研究中，我们旨在探讨调控损伤后细胞外基质重塑的治疗潜力。首先，我们研究了广谱基质金属蛋白酶抑制剂Galardin的药物治疗是否能够改善细胞外基质环境，从而提升脊髓损伤后的治疗效果。其次，为了开发出有效的局部递送系统用于联合治疗，我们设计了不同交联密度的水凝胶，因为植入生物材料的生物相容性以及机体对它的反应在很大程度上受其机械性能的影响。在评估这些候选水凝胶时，我们还特别分析了它们与免疫细胞的相互作用，这是判断其能否作为递送载体的关键因素。研究结果表明，由交联密度决定的基质硬度会对巨噬细胞的行为产生显著影响。第三，基于这些发现，我们设计并评估了一种集成治疗策略。我们选择了生物相容性最佳的水凝胶作为载体，通过pH响应型前药纳米颗粒同时递送Galardin和神经营养因子碱性成纤维细胞生长因子，以此同时解决过度细胞外基质重塑、炎症问题以及缺乏再生信号的问题。

因此，我们提出假设：脊髓损伤后的病理性细胞外基质变化会主动形成一种阻碍再生和修复的微环境，而通过经过机械优化设计的生物材料载体来实施的联合治疗策略则有望促进功能恢复。本研究旨在阐明细胞外基质沉积在脊髓损伤病理机制中的作用，并探索一种针对脊髓损伤的新型多功能治疗策略。

章节节选

不同交联程度水凝胶的制备

首先将200毫克壳聚糖（Aladdin，C105802）溶解在10毫升醋酸中，从而制得2%的壳聚糖溶液。再将200毫克明胶（Aladdin，G108396）溶解在去离子水中，并不断搅拌直至完全溶解，由此得到明胶溶液。最后将100毫克根皮素（Aladdin，G101204）溶解在1毫升PBS中并充分混合，得到根皮素溶液。三种类型的水凝胶制备方法如下：低交联密度水凝胶是通过混合300

脊髓损伤后过度的细胞外基质沉积会导致损伤部位局部硬度增加

研究表明，脊髓损伤后损伤部位会出现细胞外基质沉积，这可能会阻碍神经修复[24]。通过对细胞外基质成分（I型胶原蛋白、层粘连蛋白）以及轴突标记物NF200的免疫荧光染色分析，发现损伤部位存在大量的I型胶原蛋白和层粘连蛋白积累。值得注意的是，轴突（NF200⁺）无法延伸穿过这个富含细胞外基质的区域（见图1A）。这些发现表明，沉积的细胞外基质为脊髓损伤后的轴突再生形成了物理和生化上的障碍。

讨论

目前，尚无有效的药物疗法可用于治疗脊髓损伤。尽管在急性期临床上会使用大剂量的甲基泼尼松龙，但由于其疗效有限且副作用严重，其治疗效果仍存在争议[34]、[35]。脊髓损伤发生后，活化的微胶质细胞和浸润的巨噬细胞会释放过多的促炎细胞因子，从而严重破坏损伤部位的微环境[36]。尽管人们已经付出了诸多努力来促进

结论

我们的研究指出，水凝胶的交联密度是决定脊髓损伤后病理性微环境的关键因素。高交联密度的水凝胶会通过Piezo1-Wwtr1信号通路加剧神经炎症，而低交联密度的水凝胶则能减轻这种炎症反应，为再生创造更有利的条件。通过将这一认知融入到含有pH响应型纳米颗粒的水凝胶平台中，我们实现了Galardin和bFGF的局部、持续联合递送，这两种物质能够同时

出版许可声明

不适用

作者贡献说明

胡思旺：资金筹集。 惠佳燕：数据整理。 吴奋赞：资金筹集。 王贝妮：文章撰写——审稿与编辑，文章撰写——初稿。 蔡雄：可视化处理。 陈向航：文章撰写——审稿与编辑，文章撰写——初稿，软件应用，方法学研究，数据整理。 徐杰：可视化处理。 李正林：文章撰写——审稿与编辑，资金筹集。 沈伟：软件应用，方法学研究。 赖安文：实验研究，数据整理。 徐龙阳：方法学研究，数据整理。 Jian

利益冲突

其他所有作者均声明没有利益冲突。

伦理审批与参与同意

本研究的实验方案和操作流程已获得浙江省温州医科大学实验动物伦理委员会的批准（批准编号SYXK-2021-0020）。

数据与材料获取途径

所有数据均可在正文或补充材料中找到。如需获取数据，请联系相应作者。

资金支持

本研究得到了中国国家自然科学基金（编号82572870、82202466）、浙江省自然科学基金（编号ZCLKLY26H1801、LZ24H150001）、宁波市自然科学基金（编号2024J470）以及温州医科大学的启动资金（编号89223001）的支持。

利益冲突声明

作者们声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。

致谢

我们感谢温州医科大学的科学研究中心在研究过程中提供的专业咨询和仪器支持。同时也要感谢Figdraw在制作图表摘要方面的帮助。

Xianghang Chen|Beini Wang|Jiayan Hui|Wei Shen|Longyang Xu|Anwen Lai|Rong Huang|Fuyi Yan|Qimin Yao|Zheng Zhang|Jie Xu|Xiong Cai|Fenzan Wu|Siwang Hu|Jian Xiao|Zhenglin Li

中国浙江省温州325035，温州医科大学第一附属医院伤口愈合科