综述：评估甲烷古菌的转运系统以促进古菌生物技术

《Biotechnology Advances》：Assessing transporter systems of methanogens to boost archaea biotechnology

　　

转运蛋白对于代谢、适应和遗传物质交换至关重要。研究人员提供了对甲烷古菌中转运机制的综合综述。讨论了用于转运蛋白鉴定的实验和生物信息学方法。强调了关于甲烷古菌转运蛋白研究的未解决问题。连接转运蛋白研究与生物技术提供了令人兴奋的机会。

论文主体部分总结如下：

**1. 引言**
甲烷古菌是地球上分布广泛的微生物，在厌氧环境中通过产甲烷作用驱动全球碳循环，并产生温室气体甲烷（CH₄）。它们被分为氢营养型、乙酸裂解型和甲基营养型三种代谢类型。氢营养型甲烷古菌可将二氧化碳（CO₂）和氢气（H₂）高效转化为CH₄，并固定分子氮（N₂），具有生物技术应用潜力。尽管核心代谢途径研究较为清楚，但跨细胞质膜的转运过程仍不清楚，涉及营养摄取、产物释放、遗传交换和蛋白质分泌等机制。已知系统包括ABC转运蛋白、Sec介导的蛋白质转位以及质子（H⁺）和钠离子（Na⁺）转位。

**2. 碳同化与能量代谢底物的摄取**
氢营养型甲烷古菌通过被动扩散摄取H₂和CO₂。部分甲烷古菌能氧化甲酸生成H₂和CO₂，其中甲酸离子（HCOO^-）主要通过膜蛋白FdhC转运。在 *Methanothermobacter thermautotrophicus* 中，*fdhCAB* 操纵子在H₂限制条件下上调，表明甲酸利用基因受底物调控。*fdhCAB* 的异源表达使 *M. thermautotrophicus* ΔH能在甲酸上生长，表明该操纵子编码甲酸摄取和氧化所需的关键机制。乙酸裂解型甲烷古菌通过乙酸通透酶（AceP）摄取乙酸，缺失 *aceP* 基因导致低乙酸浓度下CH₄形成减少至野生型的25%。AceP活性可能与γ-碳酸酐酶（Cam）偶联。甲基营养型甲烷古菌利用多种甲基化底物，甲醇被动扩散，而甲胺需要通过特定转运蛋白，如三甲胺转运蛋白MttP和甲基硫代丙酸转运蛋白MtpP。

**3. 氮摄取与铵转运**
氮是氨基酸和核酸合成的必需元素。N₂通过扩散进入细胞。铵（NH₄⁺）是主要氮源，但游离氨（NH₃）被动扩散，而NH₄⁺需通过铵转运蛋白（Amt）主动摄取。在 *Methanosarcina mazei* 中，小蛋白sP36与Amt和GlnK相互作用，在高NH₄⁺水平下抑制转运，防止毒性。NH₄⁺和N₂的可利用性影响 *M. marburgensis* 的氨基酸合成与分泌模式。

**4. 微量元素转运**
微量元素如镍（Ni²⁺）、钴（Co²⁺）、铁（Fe²⁺）、钨（WO₄^2-）和钼（MoO₄^2-）对甲烷古菌能量代谢至关重要。Ni²⁺和Co²⁺分别通过ABC转运系统（如Nik/CbiMNQO和NikABCDE）和NiCoT型转运蛋白摄取。铁通过FeoB系统摄取。钨和钼通过ABC转运蛋白ModABC和WtpABC摄取。锌和镁的转运系统尚未充分表征。调节微量元素组成可改变 *M. marburgensis* 的氨基酸生产模式，并提高生物量浓度和CH₄产率。改善金属转运系统可用于生物修复和资源回收。

**5. 质子与钠离子转位**
产甲烷作用产生的ATP依赖于化学渗透偶联，利用Na⁺或H⁺电化学梯度。古菌拥有A₁A₀-ATP酶，可同时利用H⁺和Na⁺。主要的Na⁺梯度由多酶复合物Mtr生成，该复合物偶联甲基转移与Na⁺挤出。H⁺梯度由膜结合酶复合物如异二硫化物还原酶（HdrED）、F₄₂₀-还原氢化酶（Fpo）和能量转换氢化酶（Ech, Eha, Ehb）生成。Na⁺/H⁺反向转运蛋白如MjNhaP1和MrpA帮助平衡离子梯度和维持细胞内pH。磁铁矿纳米颗粒促进 *M. barkeri* 的细胞外电子传递（EET），涉及Vht、Fpo、HdrDE等转运蛋白。

**6. 蛋白质氨基酸转运蛋白**
甲烷古菌的氨基酸转运蛋白存在多样性。*M. maripaludis* 通过丙氨酸通透酶摄取L-和D-丙氨酸。*M. voltae* PS 通过Na⁺依赖的分支链氨基酸（BCAA）转运系统摄取亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。*M. marburgensis* 中亮氨酸转运系统通过代谢工程得到了间接验证，其亮氨酸产量提高了超过25,000倍。苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸等氨基酸的转运也通过Na⁺依赖系统进行。

**7. 相容性溶质转运蛋白**
甘氨酸甜菜碱是甲烷古菌中研究最充分的相容性溶质。多种甲烷古菌具有特异性摄取系统，如 *M. mazei* G?1的OtaABC转运蛋白，由 *otaABC* 操纵子编码，包括ATP酶、膜组分和底物结合蛋白。摄取随盐度增加而增加，表明盐调控。*M. thermophila* TM-1 的高亲和力甘氨酸甜菜碱转运系统速率随NaCl浓度增加而上升约70倍，提示离子偶联转运。

**8. 磺酸盐转运蛋白**
辅酶M（2-巯基乙磺酸盐）是产甲烷作用的C1载体。*M. ruminantium* 不能从头合成辅酶M，需通过 *ssu* 操纵子编码的ABC转运蛋白摄取。结构类似物2-溴乙磺酸盐（BES）可抑制Mcr，且BES抗性菌株的 *ssu* 操纵子发生突变，支持其在磺酸盐摄取中的作用。

**9. 蛋白质与细胞包膜组分转运蛋白**
甲烷古菌具有多样化的细胞包膜，其生物发生需要将胞质合成的包膜蛋白转运穿过细胞质膜（CM）。主要途径包括Sec途径和Tat途径。Sec途径介导未折叠蛋白的共翻译和后翻译转运，由SecY、SecE和Sec61β组成三聚体通道。Sec途径也参与S层蛋白的整合，具有生物技术应用潜力。Tat途径转运正确折叠的蛋白质，由TatA、TatB和TatC组成。在 *M. thermautotrophicus*、*M. mazei* 和 *M. acetivorans* 中预测了含双精氨酸基序的Tat底物。翻转酶如MurJ和AglR分别介导脂质II和磷酸多萜醇-甘露糖的转位，参与肽聚糖和N-糖基化过程。

**10. 线性DNA的定向转运**
在 *M. maripaludis* 中鉴定出负责线性DNA摄取的转运蛋白MMJJ13030，该蛋白对自然转化至关重要。结构建模显示其孔径足以通过线性DNA，支持胞外核酸酶将DNA线性化后摄取的机制。

**11. 其他有机化合物的可能转运蛋白**
*M. acetivorans* 和 *M. barkeri* 能在丙酮酸上生长，但丙酮酸特异性转运蛋白尚未在古菌中鉴定。葡萄糖摄取通过重组葡萄糖摄取促进子在 *M. acetivorans* 中实现，但效率低。在 *Methermicoccus shengliensis* 中，转导样蛋白（Tlp）感知2-甲氧基苯甲酸，并与MATE家族转运蛋白MatE相互作用实现底物摄取，*matE* 缺失导致生长受损和CH₄产量减少约95%。

**12. 维生素B₁₂的转运**
在 *Halobacterium* 中鉴定出细菌维生素B₁₂ ABC转运蛋白的同源物（BtuC、BtuD、BtuF）。尽管在甲烷古菌中尚无实验证据，但 *btu* 基因同源物存在于多个甲烷古菌基因组中。大多数甲烷古菌培养基中补充维生素B₁₂。

**13. 转运蛋白的鉴定**
生理学方法包括表型分析、抑制研究、适应性实验室进化（ALE）和抗性分析。遗传修饰方法包括基因缺失或沉默、互补或异源表达、转座子诱变、转运活性测定。生物信息学方法通过Pfam模型和HMM搜索对甲烷古菌基因组进行初步分析，识别候选转运蛋白，但存在假阳性和假阴性。该分析揭示了转运蛋白在古菌中的分布情况，并指出许多模型缺乏特异性。

**14. 未解决问题**
关键优先事项是确定预测转运蛋白的生理功能、底物特异性和调控机制。基本问题包括：哪些转运蛋白介导糖类、丙酮酸、维生素、脂质和抗生素的摄取？如何克服当前方法在研究低丰度或疏水底物时的局限性？一旦功能确定，可指导甲烷古菌工程化应用，如氨基酸生产。

**15. 结论与未来展望**
甲烷古菌拥有多样化的转运系统，支持其代谢灵活性和生态适应性。未来研究应聚焦于转运蛋白的功能表征，结合多组学分析和新兴遗传工具。从生物技术角度看，调控转运系统可改善蛋白质氨基酸和CH₄的生产，FdhC可促进全CO₂转化，ATP酶和能量转换氢化酶的修饰可增强生物燃料生产。Sec途径的工程化可用于蛋白质分泌。金属转运系统可用于生物修复和资源回收。连接基因组潜力和实验验证的转运蛋白功能将推动古菌生理学理解和生物技术应用。