转铁蛋白受体的上调介导同型半胱氨酸对脑内皮细胞的细胞毒性作用

《Brain Research》：Transferrin receptor upregulation mediates homocysteine-induced cytotoxicity in cerebral endothelial cells

　　

摘要

高同型半胱氨酸血症是认知功能受损的已知风险因素，包括阿尔茨海默病，但同型半胱氨酸积累与脑功能障碍之间的机制仍不明确。脑微血管内皮细胞是血脑屏障的重要组成部分，在维持中枢神经系统稳态中起着关键作用。然而，同型半胱氨酸如何影响这些细胞至今尚未完全明了。在本研究中，我们利用人类脑微血管内皮细胞系hCMEC/D3，通过CCK-8试验测定同型半胱氨酸的半数抑制浓度，随后进行转录组分析，以找出与内皮细胞损伤相关的受同型半胱氨酸调控的基因。同型半胱氨酸以剂量依赖的方式降低hCMEC/D3细胞的存活率，其半数抑制浓度约为12.25毫米摩尔，因此我们选择10毫米摩尔的同型半胱氨酸用于后续实验。转录组测序显示转铁蛋白受体基因显著上调，这一结果通过定量实时PCR和西方印迹分析得到了验证。从功能上来看，TFRC过表达可模拟同型半胱氨酸导致的细胞存活率下降，而TFRC敲低则能部分缓解同型半胱氨酸引起的细胞毒性。这些结果表明TFRC参与了同型半胱氨酸对脑微血管内皮细胞的损伤。总体而言，我们的体外研究结果为未来关于高同型半胱氨酸血症相关血脑屏障功能障碍的体内研究提供了线索。

引言

认知功能受损是神经退行性疾病和血管性认知障碍的典型特征（Montine等人，2021年）。它已成为全球重大的健康问题。维持稳定认知功能的关键在于血脑屏障的完整性（Chen等人，2025年）。血脑屏障是一种特殊的血管结构，由脑微血管内皮细胞、周细胞以及星形胶质细胞的足突构成（Kim等人，2022年）。在这些成分中，脑内皮细胞构成了血脑屏障的核心（Chang等人，2025年）。它们形成一道物理屏障，阻止有毒物质进入中枢神经系统，同时选择性地允许营养物质进入（Acioglu和Elkabes，2025年）。脑微血管内皮细胞功能受损会破坏血脑屏障的完整性（Callewaert等人，2024年），从而导致外周神经毒素侵入大脑，打破神经元稳态，进而引发认知功能下降（Zhou等人，2022年）。不过，同型半胱氨酸如何影响作为血脑屏障关键组成部分的脑微血管内皮细胞，目前仍不清楚。

流行病学和临床研究一致表明，通常定义为血浆同型半胱氨酸水平超过15微摩尔的状况，与认知功能受损的风险增加密切相关。在本研究中，“同型半胱氨酸”指的是用于体外细胞实验的同型半胱氨酸，而“高同型半胱氨酸血症”则指体内的病理状态。血浆中同型半胱氨酸水平升高与神经退行性疾病的发生风险增加有关（Lin等人，2025年）。这些临床发现表明，同型半胱氨酸是可干预的认知功能受损风险因素，但其与认知功能下降之间的机制尚不完全清楚。虽然生理状态下血浆中的同型半胱氨酸浓度通常在微摩尔范围内，但用于研究同型半胱氨酸诱导的细胞损伤的体外实验往往需要更高的浓度，以便在有限的实验时间内获得可重复且可测量的生物学效应。

越来越多的证据表明，同型半胱氨酸可能通过损害对维持血脑屏障完整性至关重要的脑微血管内皮细胞，从而引发认知功能受损。在动物模型中，长期暴露于高浓度同型半胱氨酸会提高血脑屏障的通透性（Carey等人，2024年）。在体外实验中，同型半胱氨酸会引发脑微血管内皮细胞的氧化应激（Sharma等人，2021年），并破坏紧密连接蛋白（Li等人，2024年）。然而，同型半胱氨酸导致损伤的分子机制仍未完全明确。一些研究人员认为，同型半胱氨酸会破坏线粒体稳态，进而导致神经元功能异常（Zhang等人，2025年）。还有研究认为，同型半胱氨酸的毒性可能与过量的活性氧生成以及血管损伤有关（L等人，2021年）。尽管先前的研究已经指出线粒体稳态破坏和过量活性氧生成与同型半胱氨酸引起的血管损伤有关，但这些应激反应与脑微血管内皮细胞损伤之间的具体分子途径仍需进一步研究。尤其是，这些过程如何与铁代谢及内皮细胞毒性相互作用，还需要更深入的研究。为此，我们利用hCMEC/D3细胞建立了体外损伤模型。我们的研究结果表明，同型半胱氨酸会以剂量依赖的方式降低细胞存活率，并显著上调TFRC的表达。值得注意的是，仅TFRC过表达就能模拟同型半胱氨酸的细胞毒性效应，而TFRC敲低则能在同型半胱氨酸作用下部分挽救细胞存活率。这些发现表明，TFRC不仅是同型半胱氨酸的下游靶标，也是介导其毒性的关键因子。本研究揭示了同型半胱氨酸引起的内皮功能障碍与铁代谢之间的新关联，并指出TFRC可能是减轻因同型半胱氨酸导致的血脑屏障损伤及认知功能下降的潜在治疗靶点。

章节摘录

试剂与仪器

本研究中使用的试剂和材料如下：人类脑微血管内皮细胞系hCMEC/D3（产品编号CL-0843）和磷酸盐缓冲液（产品编号G0002-2 L）购自中国武汉的Procell公司；L-同型半胱氨酸（产品编号HY-W010347-100毫克）购自美国MCE公司；胰蛋白酶-EDTA溶液（1倍浓度）和0.25%胰蛋白酶-EDTA（产品编号25200056）购自美国Gibco公司；内皮细胞培养基（产品编号1001）购自美国ScienCell公司；总蛋白提取试剂盒（产品编号

hCMEC/D3细胞中同型半胱氨酸的剂量依赖性细胞毒性及半数抑制浓度测定

为了评估同型半胱氨酸对脑微血管内皮细胞的细胞毒性，我们首先使用CCK-8试剂进行了剂量反应试验。将hCMEC/D3细胞暴露在不同浓度的同型半胱氨酸中（0–50毫米摩尔），持续24小时。在0.5毫米摩尔和1毫米摩尔浓度下，细胞存活率基本保持不变，约为85%±5%（P值大于0.05）；当同型半胱氨酸浓度达到5毫米摩尔时，细胞存活率显著下降，约为70%±5%，相比对照组有所降低。随着浓度进一步升高

讨论

血浆中同型半胱氨酸水平升高（通常定义为超过15微摩尔）与神经认知障碍存在密切的临床关联。它现已被认定为认知功能受损的独立风险因素，这类认知功能受损包括轻度认知障碍和阿尔茨海默病（Price等人，2018年）。多项前瞻性研究和元分析也证实，老年人血液中同型半胱氨酸水平越高，患痴呆症和阿尔茨海默病的风险也越大。尽管存在这种流行病学上的关联，但其背后的机制

结论

本研究表明，同型半胱氨酸通过上调铁吸收的关键调节因子TFRC，从而降低人类血脑屏障内皮细胞的存活率。总结来说，同型半胱氨酸会升高脑内皮细胞中的TFRC水平，进而降低细胞存活率，同时还会导致铁元素积累和氧化应激。因此，TFRC既是同型半胱氨酸引起内皮损伤的关键介质，也是在高同型半胱氨酸环境下保护血脑屏障的潜在治疗靶点。不过，这些体外研究结果仍需要在体内环境中得到进一步验证。

资助情况

本项目得到了深圳市南山区“科技研发与创意设计项目”（项目编号NS.2025006）的资助。

数据可用性

数据将在收到请求后提供。

CRediT作者贡献说明

王杰：实验验证、研究监督、正式数据分析。 刘瑶琴：数据可视化、实验验证、项目管理、方法学设计、正式数据分析、数据整理。 江长宇：实验验证、资源协调、资金筹集、正式数据分析、概念构思。 王丹丹：论文撰写与修改、项目管理。 王金华：实验验证、研究监督、正式数据分析。 冯光举：研究监督、软件应用、资金筹集、正式数据分析、数据整理。 钟斌：论文撰写与修改

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。

致谢

我们感谢江长宇实验室的所有成员在技术支持和重要建议方面给予的宝贵帮助。

Jie Wang|Yaoqin Liu|Changyu Jiang|Dandan Wang|Jinhua Wang|Guangju Feng|Bin Zhong

中国云南民族大学