芦丁通过抑制小胶质细胞HIF-1α/PKM2驱动的糖酵解改善围术期神经认知障碍

《Brain Research Bulletin》：Rutin ameliorates perioperative neurocognitive disorders by inhibiting microglial HIF-1α/PKM2?driven glycolysis

　　

围术期神经认知障碍（PND）是老年患者在手术和麻醉后常见的神经系统并发症。这些障碍涵盖了一系列认知缺陷，包括记忆受损、注意力下降和执行功能减退。随着全球人口的快速老龄化，PND的发病率持续上升，对术后恢复和长期生活质量构成了重大挑战。尽管进行了广泛的研究，但PND背后的确切机制仍不完全清楚，且缺乏有效的治疗策略。神经炎症被认为是PND的核心致病机制。手术创伤引发全身炎症反应，并蔓延至中枢神经系统，导致脑部主要的免疫细胞——小胶质细胞激活。激活的小胶质细胞释放促炎细胞因子，如白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6），这些因子会导致神经元功能障碍和突触损伤，特别是在海马体中。越来越多的证据表明，代谢重编程是调节神经炎症性疾病中小胶质细胞激活的基本机制。受到刺激后，小胶质细胞发生从氧化磷酸化到糖酵解的代谢转变，这种变化与促炎表型密切相关。缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是这种糖酵解开关的关键调节因子，促进免疫细胞中糖酵解酶和炎症基因的表达。芦丁是一种天然存在的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎和神经保护作用。然而，芦丁在PND中的潜在作用及其潜在的分子机制尚未得到充分阐明。在本研究中，研究人员探讨芦丁是否能减轻手术引起的认知障碍并探索其潜在机制。研究人员提出假设，手术诱导了以HIF-1α依赖性糖酵解为特征的小胶质细胞代谢重编程，这导致了神经炎症和认知障碍；而芦丁通过抑制小胶质细胞中由HIF-1α/PKM2介导的糖酵解途径发挥神经保护作用。

围术期神经认知障碍（PND）是老年患者在经历手术和麻醉后常见的神经系统并发症，临床表现为记忆力减退、注意力下降和执行功能减退等认知缺陷。随着全球人口老龄化加剧，PND的发病率持续攀升，严重阻碍了患者的术后康复并降低了长期生活质量。尽管医学界对此进行了大量探索，但其确切病理机制仍未被完全阐明，临床上也缺乏切实有效的靶向治疗手段。研究普遍表明，神经炎症在PND的发病机制中扮演着核心角色。手术创伤会触发全身炎症反应，进而波及中枢神经系统，导致脑内主要的免疫细胞——小胶质细胞被过度激活。这些激活的小胶质细胞会大量释放白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）等促炎细胞因子，从而引发海马区的神经元功能障碍与突触结构受损。近年来，免疫代谢重编程被认为是调控小胶质细胞激活的一项基础机制。当受到炎症刺激时，小胶质细胞的代谢模式会从氧化磷酸化向糖酵解转变，这一代谢重构与其促炎表型的转化密切相关。在该过程中，缺氧诱导因子-1α（HIF-1^α）作为糖酵解途径的关键调控因子发挥了至关重要的作用，它能够促进免疫细胞内糖酵解酶及炎症相关基因的表达。芦丁是一种广泛存在于水果和药用植物中的天然黄酮类化合物，既往研究证实其具有抗氧化、抗炎和神经保护等多重药理特性。然而，芦丁在PND中的潜在疗效及其具体分子机制尚不明确。基于此，本研究旨在探讨芦丁能否改善手术诱发的认知功能障碍并揭示其潜在机制。研究人员提出假设：手术应激诱导的小胶质细胞代谢重编程依赖于HIF-1^α介导的糖酵解，进而引发神经炎症和认知障碍；而芦丁通过抑制小胶质细胞中HIF-1^α/PKM2介导的糖酵解途径发挥神经保护作用。本研究发表于《Brain Research Bulletin》杂志，为阐明PND的发病机制及治疗靶点提供了新视角。

在研究方法上，研究人员主要采用了以下关键技术：首先，建立18个月龄的雄性C57BL/6 J小鼠剖腹探查手术诱导的PND模型，并给予芦丁干预；通过Morris水迷宫（MWM）和恐惧条件反射测试（FCT）评估空间学习记忆和认知功能；利用免疫荧光染色技术观察海马区神经元结构、突触蛋白表达及小胶质细胞的激活与极化状态；运用Western blot和定量实时PCR检测HIF-1^α、PKM2等糖酵解相关基因和蛋白的表达水平；在体外实验中，使用脂多糖（LPS）刺激BV2小胶质细胞构建炎症模型，并转染HIF-1^α过表达慢病毒以验证机制；此外，借助Seahorse XF能量代谢分析仪实时检测细胞外酸化率（ECAR）和耗氧率（OCR），评估糖酵解通量及线粒体呼吸功能。

Rutin alleviates surgery-induced cognitive impairment in mice
通过构建小鼠剖腹探查手术模型并结合行为学测试，研究发现手术组小鼠在MWM训练阶段的逃避潜伏期显著延长，且在空间探索试验中目标象限停留时间和跨越平台次数明显减少；而在FCT测试中，手术小鼠的僵直时间显著缩短。给予200 mg/kg剂量的芦丁治疗后，小鼠的逃避潜伏期显著降低，目标象限停留时间和跨越平台次数增加，且僵直时间得到恢复。各组小鼠游泳速度无显著差异，排除了运动能力缺陷的干扰。结果表明，芦丁能够有效缓解手术诱导的小鼠认知功能障碍。

Rutin preserves neuronal structure and synaptic protein expression following surgery
通过海马区免疫荧光染色实验，研究发现手术组小鼠海马组织中微管相关蛋白2（MAP2）的表达显著降低。对突触完整性标志物的检测显示，突触前膜蛋白Bassoon和突触后骨架蛋白Homer的表达在术后均出现明显下降，而芦丁干预可显著逆转上述蛋白的表达水平。此外，芦丁治疗组海马组织中IL-1^β、TNF-^α、IL-6等促炎因子的水平也显著降低。结论表明，芦丁能够保护海马神经元结构和突触完整性，并减轻手术引发的神经炎症。

Rutin inhibits microglial activation and pro-inflammatory polarization
应用小胶质细胞标志物Ionized calcium binding adaptor molecule 1（Iba1）进行免疫荧光分析，结果显示手术应激诱导了海马区小胶质细胞的强烈激活，表现为Iba1免疫反应性增强及细胞形态由静息态的分枝状向激活态的阿米巴样转变。对细胞极化状态的评估发现，术后促炎标志物CD16表达显著上调，而抗炎标志物CD206表达下降。芦丁治疗后，不仅Iba1激活受到抑制，CD16表达显著降低，部分小胶质细胞的形态也恢复了静息态特征。结果证实，芦丁能够抑制术后小胶质细胞的过度激活并阻断其促炎表型转化。

Rutin inhibits microglial glycolysis via the HIF-1^α/PKM2 signaling pathway
通过定量实时PCR和生物化学检测，研究发现手术组小鼠海马组织中HIF-1^α、PKM2、LDHA、GLUT1等糖酵解相关基因的表达显著上调，且乳酸生成量明显增加。Western blot结果显示HIF-1^α和PKM2蛋白水平在术后显著升高。双标免疫荧光染色证实，HIF-1^α主要在激活的小胶质细胞中表达上调。芦丁处理显著降低了上述基因和蛋白的表达并减少了乳酸堆积。体外实验中，Seahorse分析表明LPS刺激显著提高BV2细胞的ECAR并降低OCR，伴随LDH活性和乳酸生成增加；而芦丁共处理显著逆转了这些代谢改变，且HIF-1^α过表达慢病毒转染能够抵消芦丁对糖酵解的抑制效应。结论指出，芦丁通过HIF-1^α/PKM2信号通路有效抑制小胶质细胞的糖酵解代谢重编程。

Rutin regulates microglial glycolysis and inflammatory activation in vitro
通过在BV2细胞中转染HIF-1^α过表达慢病毒，研究进一步验证了分子机制。HIF-1^α过表达不仅逆转了芦丁对BV2细胞ECAR、OCR、LDH活性及乳酸生成的调节作用，还导致PKM2表达回升。同时，LPS+芦丁+ov-HIF-1^α组中CD16表达及IL-1^β、TNF-^α、IL-6等炎症因子的分泌量较LPS+芦丁+ov-NC组显著上升。结果表明，芦丁对小胶质细胞炎症激活和代谢重编程的调节作用高度依赖于HIF-1^α信号通路。

在讨论部分，本研究深入总结了芦丁的神经保护机制。研究证实，手术应激触发海马区小胶质细胞内由HIF-1^α/PKM2轴介导的糖酵解代谢转变，进而引发严重的神经炎症与突触损伤。芦丁的给药治疗有效抑制了这条代谢途径，恢复了细胞内的代谢稳态，从而保护了认知功能。这一结果不仅印证了小胶质细胞免疫代谢在PND病理过程中的核心地位，也为靶向细胞代谢通路治疗手术相关认知障碍提供了有力的理论依据。研究也客观指出了存在的几点局限：首先，尽管证实了HIF-1^α/PKM2通路在其中的关键作用，仍需借助条件性敲除模型开展进一步的遗传学验证；其次，本研究样本仅限于雄性小鼠，芦丁对雌性老年小鼠是否具有同等疗效尚待阐明；第三，实验设计未设置仅使用芦丁的对照组，未排除潜在的基线非特异性影响；第四，研究中主要评估了兴奋性突触功能标志物，缺乏对抑制性突触标记分子的考量，未来需全面探究；第五，芦丁采用全身系统性给药方式，外周系统的免疫调节作用可能在一定程度上中介了中枢神经免疫反应，后续需利用脑靶向递送系统以区分中枢与外周机制；第六，体外模型选用LPS而非组织损伤相关分子模式，虽然具备广泛的验证性和对比性，但未来需采用DAMPs模型以更精确地模拟手术无菌性炎症；最后，研究尚未评估芦丁对术后长期认知功能的持久保护效应。总而言之，本研究得出结论：芦丁通过抑制小胶质细胞的过度激活及其依赖于此的HIF-1^α/PKM2驱动的糖酵解途径，有效遏制了代谢重编程，进而显著缓解了手术导致的认知功能受损。这一发现凸显了微胶质细胞免疫代谢在PND发病机制中的关键作用，并为将靶向代谢途径作为预防围术期相关认知障碍的潜在临床治疗策略提供了坚实依据。