在斑马鱼早期生命阶段的敏感发育时期，星形胶质细胞活化通过rxrga/tsp-1轴介导了UV过滤剂PBSA所引起的神经发生受损

《Chemico-Biological Interactions》：Astrocyte activation mediates UV filter PBSA-induced impairment of neurogenesis via the rxrga/ tsp-1 axis during a sensitive developmental window in early life stage zebrafish

　　摘要：2-苯基苯并咪唑-5-磺酸（PBSA）是一种广泛使用的有机紫外线过滤剂，常在水生环境中被检测到，但其发育神经毒性却鲜有研究。本研究让斑马鱼胚胎暴露于0.1-1000 μg/L的PBSA中，确定10 μg/L为有效浓度，受精后6-48小时为PBSA引发发育神经毒性的敏感阶段。在该关键时期暴露于10 μg/L PBSA会导致活性氧水平及炎症反应显著上升，特定脑区星形胶质细胞活性增强（GFAP、S100B和谷氨酰胺合成酶水平升高），同时神经发生受到抑制，而细胞凋亡并未加剧。此外，PBSA还会上调视黄酸X受体γ（rxrga）表达，下调血栓调节蛋白-1（tsp-1）表达，且rxrga与星形胶质细胞活化标志物呈正相关，与tsp-1水平呈负相关。使用莫尔菲诺敲低rxrga后，可在受精后120小时逆转PBSA引发的tsp-1水平下降、神经发生受损及行为异常，但星形胶质细胞活化未受影响，表明星形胶质细胞活化可能发生在rxrga之前。总体而言，这些研究结果表明，PBSA在敏感发育阶段通过氧化应激、炎症反应及星形胶质细胞活化引发发育神经毒性，而rxrga/tsp-1轴则介导了神经发生的抑制。这项研究为理解PBSA的神经毒性机制提供了依据，也强调了在紫外线过滤剂安全性评估中纳入发育神经毒性检测的重要性。

引言：2-苯基苯并咪唑-5-磺酸（PBSA）是一种亲水性有机紫外线过滤剂，因其优异的紫外线吸收性能和良好的水溶性，被广泛应用于防晒霜和护肤品等个人护理产品中。尽管应用广泛，但其在废水处理中的去除率较低（平均仅为11 ± 36%），因而成为水生环境中最常被检测到的紫外线过滤剂之一（Inbaraj等人，2002；O'Malley等人，2020；Orlikowska等人，2015）。澳大利亚的污水处理厂每天会向污水中排放约9.3公斤PBSA，其浓度可高达4560 ng/L（O'Malley等人，2020）。除了废水系统外，PBSA在河流、沿海水域和开阔海洋中也能长期存在，河口地区的浓度峰值可达170 ng/L（Orlikowska等人，2015）。该化合物可通过多种途径进入人体，包括通过个人护理产品接触皮肤以及饮用受污染的水，因此具有对人类和水生生物造成长期暴露风险的潜在危害。鉴于此，PBSA的环境归趋及其生态危害已引起广泛关注。目前关于PBSA的研究主要集中在其环境分布、迁移规律上，近期才有研究开始探讨其毒性作用。例如，终生暴露于20 μg/L PBSA会扰乱下丘脑-垂体-性腺-肝脏轴，抑制斑马鱼的卵巢发育，降低其繁殖能力，并导致后代出现发育异常（Tao等人，2023）。急性暴露于3 μg/L PBSA也会显著干扰信号小龙虾Pacifastacus leniusculus的心率及运动行为（Malinovska等人，2023）。此外，PBSA还会在斑马鱼肝脏中引发剂量依赖性的氧化应激，进而导致抗氧化酶活性下降和脂质过氧化（Huang等人，2020）。尽管已有这些发现，但针对PBSA特定毒性终点的深入研究，尤其是发育神经毒性方面的研究仍十分有限。鉴于发育中的神经系统易受外来物质影响，加之PBSA作为新兴水生污染物的使用日益普遍，PBSA对神经发育过程的干扰及其背后的分子机制仍有许多未知之处。填补这一知识空白对于完善紫外线过滤剂的生态风险评估体系至关重要。因此，系统研究PBSA的发育神经毒性及其分子机制，对于推进环境风险管理、制定基于证据的监管标准具有十分重要的意义。

视黄酸X受体（RXR）包含三种亚型：RXRα、RXRβ和RXRγ（Evans和Mangelsdorf，2014）。这些亚型可通过形成同二聚体或与多种核受体形成异二聚体来发挥转录调控功能，从而调节靶基因的表达。RXR信号通路在胚胎干细胞、神经前体细胞和神经元中起着关键的转录调控作用，其功能紊乱与神经退行性疾病密切相关（Duester，2013；Gudas和Wagner，2011；Simandi等人，2018）。RXRγ逐渐被认定为紫外线过滤剂引发发育神经毒性的重要调控因子。例如，小鼠胚胎神经元在产前暴露于50 mg/kg/天的紫外线过滤剂苯甲酮-3（BP3）时，RXRα和RXRβ表达会发生变化，而RXRγ表达则上升，进而干扰与神经发生相关的基因转录（Wnuk等人，2019）。我们利用斑马鱼开展的研究也证实，环境浓度下的BP3会显著上调rxrgb表达，引发斑马鱼胚胎的细胞凋亡及后续神经毒性损伤（Tao等人，2020）。值得注意的是，近期研究还发现RXR在调控中枢神经系统中的星形胶质细胞功能方面也起着重要作用（Zhang-Gandhi等人，2007；Xu等人，2006；Liang等人，2004）。在帕金森病模型中的研究表明，RXRα水平升高会导致胶质纤维酸性蛋白的免疫反应性降低，进而抑制星形胶质细胞的活性（Zhylkibayev等人，2025）。然而，在PBSA引发的发育神经毒性背景下，RXRγ与星形胶质细胞活化状态之间的具体相互作用仍不明确。

血栓调节蛋白-1（TSP-1）由星形胶质细胞分泌，是一种重要的细胞外基质蛋白，在调控神经发生过程中发挥着关键的分子靶标作用（Christopherson等人，2005）。研究表明，TSP-1能够促进具有正常超微结构特征的突触形成，因此在神经系统的成熟和再生过程中起着重要作用（Cheng等人，2016；Christopherson等人，2005）。TSP-1的异常表达与多种神经退行性疾病密切相关。例如，在阿尔茨海默病中，淀粉样β蛋白会通过自噬途径降低星形胶质细胞对TSP-1的分泌，而补充TSP-1可通过其神经元受体α2δ1缓解Aβ引发的突触损伤（Kang等人，2018；Son等人，2015）。此外，唐氏综合征和脆性X综合征的模型中也观察到星形胶质细胞中TSP-1表达不足，从而导致树突棘异常和突触丢失，而恢复TSP-1水平则可以改善这些状况（Cheng等人，2016；Garcia等人，2010；Torres等人，2018）。另外，氧化应激和慢性氨暴露也会干扰星形胶质细胞对TSP-1的正常分泌，进而导致突触蛋白丢失（Chen等人，2011；Jayakumar等人，2014）。鉴于星形胶质细胞分泌的TSP-1在维持神经发育稳态中的关键作用，以及星形胶质细胞功能、RXR信号通路和TSP-1分泌之间的潜在相互作用，可以推测在PBSA引发的神经毒性过程中，这些因素之间存在一定的因果关系。不过，目前尚缺乏直接支持这一因果关联的证据。

斑马鱼因其体型小巧、繁殖能力强，且在遗传、形态和生理特征上与人类高度相似，被广泛用于发育生物学和毒理学研究（d'Amora和Giordani，2018）。斑马鱼的大脑结构和感觉运动回路与人类相当（Panula等人，2010）。斑马鱼胚胎具有光学透明性，便于直接观察关键的细胞过程（He等人，2014；Panula等人，2010）。此外，斑马鱼幼体表现出简单的行为，这些行为由特定的神经回路和细胞类型调控，有助于将行为表现与相应的结构和细胞成分联系起来（Orger和de Polavieja，2017；Tao等人，2020）。在本研究中，我们以斑马鱼作为脊椎动物模型，探究PBSA的发育神经毒性。具体而言，我们首先通过观察早期发育和行为缺陷，确定了能引发发育神经毒性表型的PBSA有效浓度，随后通过系统分析行为表现，找到了从原肠期到幼体期（受精后6至96小时）的敏感发育阶段。我们的研究重点关注在这一关键发育阶段，PBSA暴露是否会对大脑特定区域的神经发生、星形胶质细胞活化产生影响，以及这些变化与行为障碍之间的功能关联。此外，我们还研究了PBSA引发发育神经毒性反应的分子机制，并通过莫尔菲诺寡核苷酸介导的基因敲低技术，找到了调控PBSA诱导的表型变化的关键因子。总体而言，本研究旨在明确PBSA的发育神经毒性效应，并揭示驱动这些变化的潜在分子机制。

斑马鱼饲养与胚胎采集：本研究使用了野生型AB品系斑马鱼，所有实验流程均获得了贵州医科大学动物实验伦理委员会的批准，批准号为2100215。成年斑马鱼在温度为28℃、光照周期为14:10、水电导率为500至1000 μS/cm的循环水系统中饲养，每天喂食两次处于相同发育阶段的丰年虾。为促使斑马鱼产卵，将它们进行配对饲养。

发育形态学筛查：与对照组相比，暴露于PBSA的各组斑马鱼在体节数量、孵化率、体长、躯干角度以及脑干/中脑/脑桥的尺寸方面均无显著差异（P > 0.05）。仅10 μg/L暴露组的幼体头长出现轻微但具有统计学意义的下降（P < 0.05；图1G）。

PBSA引发神经行为毒性的有效浓度与敏感阶段：自发运动实验显示，在受精后22小时时，10 μg/L PBSA处理组的每分钟自发运动次数显著减少。

讨论：作为一种紫外线过滤剂，PBSA的发育神经毒性目前尚未得到充分研究。本研究发现，受精后6-48小时是斑马鱼对PBSA产生神经发育毒性反应的敏感阶段。在此阶段暴露于10 μg/L PBSA会引发多种发育神经毒性表型，如受精后22小时时自发运动活动增加，受精后120小时时运动反应过度，探索行为减少，以及受精后120小时时空间偏好改变。这些观察结果表明……

结论：总之，本研究评估了在敏感发育阶段（受精后6-48小时）暴露于环境相关浓度PBSA的斑马鱼所出现的发育神经毒性。研究结果表明，这一阶段是PBSA引发神经毒性效应的关键时期，PBSA在此阶段的暴露主要通过激活星形胶质细胞而非引发细胞凋亡来抑制胚胎的神经发生。敲低实验为这一机制提供了初步的支持。

作者贡献声明：熊晨：写作——审稿与编辑、可视化、验证、监督、正式分析、概念设计。周一平：正式分析、概念设计。刘宇波：方法学、研究实施。钱志遥：方法学、研究实施。齐传娇：方法学、研究实施。王俊利：研究实施、正式分析、概念设计。田林轩：写作——初稿撰写、方法学、研究实施、正式分析、数据整理。杨勤远：写作——初稿撰写。

利益冲突声明：作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

数据可用性：数据可应要求提供。

资金支持：本研究由中国国家自然科学基金资助（项目编号：22166014）。

利益冲突声明：? 作者声明存在以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：有专利申请中。其他作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

杨勤远|田林轩|王俊利|齐传娇|钱志遥|刘宇波|周一平|熊晨|陶俊岩
中国贵州省贵阳市贵州医科大学公共卫生学院、环境污染物监测与疾病控制重点实验室，邮编561113