《Food Chemistry: X》：Enhanced antibacterial performance of chili pepper seed protein hydrolysates by high hydrostatic pressure assisted enzymatic hydrolysis on
Staphylococcus aureus: structural basis and mechanistic insights
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金黄色葡萄球菌的抗生素耐药性威胁公共卫生。植物副产品蛋白水解物含有抗菌肽作为抗生素替代品，但紧凑的天然蛋白结构限制了水解效率和抗菌片段的释放。本研究应用高静水压（HHP）辅助木瓜蛋白酶水解辣椒籽蛋白（PSP），以提高水解效率和抗菌活性。加压（100–500?M
金黄色葡萄球菌的抗生素耐药性威胁公共卫生。植物副产品蛋白水解物含有抗菌肽作为抗生素替代品，但紧凑的天然蛋白结构限制了水解效率和抗菌片段的释放。本研究应用高静水压（HHP）辅助木瓜蛋白酶水解辣椒籽蛋白（PSP），以提高水解效率和抗菌活性。加压（100–500?MPa）使PSP水解度提高4.48–28.84%。在100?MPa下水解产生的水解物具有最佳抗菌活性，抑制率和抑菌圈分别提高18.90%和10.25%。结构和理化分析表明，在100?MPa下水解使α-螺旋含量增加23.15%，表面疏水性增加20.50%，<3?kDa肽增加284.07%，并改善了溶解性和分散性。这些变化增强了水解物结合和破坏膜的能力，并形成了有利的抗菌微环境。这些结果提供了一种优化酶解和辣椒籽高值化利用的有效策略。
**研究背景与问题**
细菌抗生素耐药性加速演变对全球公共卫生、食品安全和生态安全构成严重威胁。其中，金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）是21世纪主要的公共卫生挑战，其耐药菌株导致高死亡率。传统单靶点抗生素因微生物适应性突变而疗效下降，亟需开发新型抗菌替代物。抗菌肽（Antibacterial peptides, AMPs）因其结构多样性呈现多模态膜靶向作用机制，能有效阻碍耐药突变演进，同时具有广谱活性和低细胞毒性。植物蛋白酶解可释放大量潜伏的“加密”抗菌肽，这些肽段在水解物中积累，成为天然抗菌肽挖掘的新资源。然而，天然植物蛋白的紧凑折叠构象、低溶解度、分子聚集和异质分散性阻碍了酶对埋藏裂解位点的可及性，导致水解度低，限制了抗菌肽片段的释放，这构成了植物蛋白水解物生物活性受限的核心瓶颈。
**研究目的与意义**
非热预处理技术（如超声、电子束辐照和高静水压）被证实可解折叠蛋白构象、改善理化性质并提高水解效率。高静水压（High hydrostatic pressure, HHP）作为一种非热加工技术，能在常温下调控植物蛋白的二级和三级结构，同时保留氨基酸序列、酶特异性和肽功能活性。现有研究主要关注HHP辅助酶解制备抗氧化和血管紧张素转化酶（ACE）抑制活性的水解物，但关于HHP辅助酶解制备抗菌水解物的研究有限，其对抗菌活性的影响机制尚不明确。中国是全球辣椒产量领先的国家，辣椒籽占辣椒干重的30–50%，蛋白质含量约17–19.83%，但多数被作为农业废弃物或低值饲料处理。因此，从辣椒籽蛋白（PSP）中制备抗菌水解物具有原料充足、成本低廉的优势，为辣椒籽加工副产物高值化利用提供途径。研究人员前期已建立PSP提取方案，发现HHP处理可诱导构象解折叠并增强PSP功能性质，并成功通过木瓜蛋白酶水解获得PSP抗菌水解物（PSPE）。在此基础上，本研究创新性地应用HHP辅助酶解制备抗菌PSP水解物，系统探究100–500?MPa压力对水解度（DH）、抗菌活性、结构和理化性质的影响，阐明其分子机制，揭示结构-抗菌活性关系，填补HHP辅助酶解制备植物源抗菌蛋白水解物的研究空白，为辣椒籽高值化利用提供绿色高效方法。论文发表在《Food Chemistry: X》。
**主要关键技术方法**
研究人员采用HHP辅助酶解技术，以新疆天椒红安农业科技有限公司提供的“红龙23”辣椒籽为原料，经碱溶酸沉法提取PSP。将PSP分散于PBS缓冲液（pH 7.5）后密封，在100–500?MPa下处理5?min，随后用木瓜蛋白酶（800.0?U/mg）于50?°C水解4?h，获得不同压力下的水解物（PSP-100E至PSP-500E，0.1?MPa为对照PSPE）。采用甲醛滴定法测定DH，通过抑制率、抑菌圈和生长曲线评估抗金黄色葡萄球菌（*S. aureus* ATCC 25923）活性，并利用UV-Vis光谱、FTIR光谱、游离巯基/二硫键测定、SEC-HPLC分子量分布、ANS荧光探针法测表面疏水性、纳米粒度仪测Zeta电位和粒径进行结构及理化表征，最后进行Pearson相关性分析。
**研究结果**
**3.1 水解度**：HHP-PSPE的DH较PSPE显著提高，100?MPa时达最大值，增加28.84%，随后随压力升高而下降，归因于适度压力诱导蛋白解折叠暴露酶切位点，而过高压导致蛋白聚集抑制水解。
**3.2 抗菌特性**
**3.2.1 抑制率和抑菌圈**：100–400?MPa下HHP-PSPE的抑制率和抑菌圈直径均显著高于PSPE，PSP-100E最佳，分别提高10.25%和18.90%，抗菌活性随压力升高先增后减，与DH趋势一致。
**3.2.2 生长曲线**：PSPE和HHP-PSPE均延长了*S. aureus*的迟滞期（从4?h延长至8–13?h），PSP-100E、PSP-200E和PSP-300E组对数期起始分别延迟约62.5%、37.5%和25%，且OD
600值持续低于PSPE，表明HHP促进了抗菌成分富集，抑制细菌增殖。
**3.3 游离氨基酸**：PSP-100E和PSP-200E中总游离氨基酸含量分别增加9.25%和12.54%，且碱性氨基酸（BAA）、芳香族氨基酸（AAA）和疏水性氨基酸（THAA）含量显著升高，与抗菌活性增强相关，提示功能氨基酸与生物活性肽形成协同抗菌系统。
**3.4 UV-Vis光谱**：HHP-PSPE在203?nm处吸收强度增加，表明更多肽键暴露；在240–300?nm区域吸收增强，指示芳香族氨基酸残基暴露，PSP-100E最强，有利于增强肽与细菌膜界面亲和力，促进膜插入。
**3.5 FTIR光谱**：HHP-PSPE的酰胺I带发生红移，无新化学键生成。二级结构定量分析显示，α-螺旋含量增加4.34–23.15%，β-折叠含量减少6.68–36.85%，其中PSP-100E α-螺旋最高（28.47%），有助于形成两亲性结构，插入脂质双层形成跨膜孔，破坏膜完整性。
**3.6 游离巯基和二硫键**：HHP-PSPE（100–500?MPa）的二硫键（-S-S-）含量较PSPE降低28.51–77.56%，100–300?MPa下游离巯基（-SH）增加7.40–32.97%，表明HHP破坏了二硫键，暴露埋藏巯基，改善蛋白溶解性和分散性，提高与膜接触概率；而过高压（400–500?MPa）导致游离巯基再氧化形成二硫键，促进蛋白聚集。
**3.7 分子量分布**：HHP-PSPE中>10?kDa大分子组分显著减少，<10?kDa小分子肽比例增加22.58–48.39%，其中<3?kDa肽含量较对照组增加185.71%（PSP-100E相对增加284.07%），低分子量肽更易发挥膜相互作用和抗菌功能。
**3.8 表面疏水性**：100–400?MPa下HHP-PSPE的表面疏水性（H0）显著高于PSPE，PSP-100E增加20.50%，暴露的疏水基团可插入细菌磷脂双层，破坏膜结构，导致细胞裂解。
**3.9 Zeta电位和粒径**：HHP-PSPE粒径减小27.29–111.91%，PSP-100E最小；Zeta电位绝对值增加，PSP-100E提高39.97%，增强静电排斥，改善分散稳定性和均匀性，使抗菌组分更易与细菌膜靶点结合。
**3.10 相关性分析**：Pearson分析显示，DH、α-螺旋比例、<3?kDa肽比例、Zeta电位与抗菌活性（抑制率、抑菌圈直径）呈显著正相关，表明HHP通过多因素协同调控蛋白结构、理化性质进而增强抗菌活性。
**总结讨论与结论**
讨论部分综合了HHP诱导的结构与理化变化对抗菌活性的增强机制：HHP在100?MPa下适度解折叠PSP，提高酶解效率和DH，释放大量低分子量（<3?kDa）生物活性肽，增加功能性游离氨基酸（BAA、AAA、THAA）含量；同时改变二级结构（增加α-螺旋、减少β-折叠），暴露表面疏水基团和芳香族残基，减小粒径并提高Zeta电位绝对值，改善溶解性和分散性。这些变化共同增强了水解物与细菌脂质双层的结合与插入能力，破坏膜完整性，延长*S. aureus*迟滞期，抑制其增殖。而过高压（>100?MPa）导致蛋白重新折叠、聚集及巯基再氧化，降低水解效率和抗菌活性。
研究结论翻译如下：本研究开发了HHP辅助酶解作为一种可行方法，旨在提高水解物的水解效率和抗菌活性。在100–500?MPa下，HHP破坏了PSP的紧凑天然结构，包括蛋白解折叠和暴露埋藏的内部酶切位点，增强酶-底物相互作用以提高DH。该处理还将蛋白质降解为大量低分子量（<3?kDa）生物活性肽，并增强了功能性疏水性、芳香族和碱性游离氨基酸的释放。此外，HHP-PSPE表现出更小的粒径、均匀的粒径分布和更高的Zeta电位绝对值，表明其在溶液中的分散性和稳定性得到改善。这些有利特性创造了稳定且分散良好的抗菌微环境，使得HHP-PSPE比PSPE更充分、更高效地发挥其抗菌性能。结构表征进一步揭示了HHP-PSPE的潜在抗菌机制：HHP改变水解物的二级结构，增加两亲性α-螺旋的比例，暴露表面疏水基团和芳香族残基。这些HHP诱导的结构变化使HHP-PSPE能够结合并插入细菌脂质双层，损害膜完整性，并引发细胞内物质泄漏。这种膜损伤通过延长迟滞期进一步抑制*S. aureus*的生长和增殖。在所有样品中，PSP-100E表现出最佳的DH和抗菌活性，这与其有利的抗菌相关结构和理化性质密切相关。然而，过高的HHP压力（>100?MPa）导致蛋白重新折叠、聚集和巯基再氧化，阻碍水解并削弱抗菌活性。Pearson相关性分析也证实，DH、α-螺旋比例、低分子量肽含量和稳定性是增强抗菌活性的关键潜在因素。本研究系统揭示了不同压力下水解效率和抗菌活性的变化规律，填补了HHP修饰植物蛋白水解物结构-抗菌活性关系的研究空白，并为辣椒籽的高值化利用提供了新途径和理论基础，也为新型抗菌肽的开发提供了资源库。
