KCl-二价盐协同替代对减钠酸肉中蛋白酶活性和挥发性风味特征的影响

《Food Chemistry: X》：Impact of KCl-divalent salt synergistic substitution on protease activity and volatile flavor profile in sodium-reduced sour meat

　　

酸肉是一种中国传统发酵制品，以其独特风味而备受青睐，这种风味是通过高盐加工实现的。然而，随之而来的过量钠摄入增加了健康风险。研究人员通过使用氯化钾（KCl）与二价盐（即氯化钙（CaCl₂）或氯化镁（MgCl₂））组合替代40%的氯化钠（NaCl），开发了一种减钠酸肉策略。该替代策略差异性地调节了内源蛋白酶：KCl-MgCl₂增强了组织蛋白酶B/L和二肽基肽酶IV（DPP IV）的活性，增加了挥发性化合物；KCl-CaCl₂提高了二肽基肽酶I（DPP I）和丙氨酰氨肽酶（AAP）的活性，促进了三氯乙酸（TCA）可溶性肽和氨基酸的生成。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）鉴定了关键风味化合物（VIP>1），相关性分析将蛋白酶活性与风味形成联系起来。该策略实现了靶向酶调控，用于生产更健康且风味改善的减钠酸肉。

**论文解读：KCl-二价盐协同替代对减钠酸肉中蛋白酶活性和风味特征的影响**

**研究背景与问题**

酸肉是中国西南地区（湖南、贵州）的传统发酵肉制品，凭借独特风味和营养价值深受喜爱。传统加工中，高盐（4%–8% NaCl）通过降低水分活度（Aw）抑制有害微生物，并调节内源酶活性以促进蛋白水解，生成风味前体物质（如游离氨基酸，FAAs）。然而，高钠摄入与高血压、心血管疾病等风险密切相关；世界卫生组织建议每日钠摄入不超过2 g，而中国成年人平均达4.18 g，89.4%超出推荐量。在此背景下，开发减钠酸肉策略迫在眉睫。现有减盐方法包括使用KCl、CaCl₂、MgCl₂等非钠盐替代部分NaCl，但替代比例超过40%时可能影响质构和风味。内源蛋白酶（组织蛋白酶、二肽基肽酶DPPs、氨肽酶）在蛋白水解级联反应中起关键作用：上游组织蛋白酶降解肌原纤维蛋白为多肽，中游DPPs进一步切割为小肽，下游氨肽酶水解为FAAs，这些FAAs经美拉德反应和Strecker降解生成挥发性风味化合物（VOCs）。不同盐离子（K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺）可能差异调节这些酶活性，从而影响风味形成。然而，现有研究多聚焦微生物组和代谢组，对内源酶活性与风味关系的关注不足。为此，研究人员开展了本研究，系统探究40% NaCl替代（KCl联合CaCl₂或MgCl₂）对内源蛋白酶活性和挥发性风味的影响，旨在为减钠发酵肉制品的质量优化和工业化生产提供理论支持。该论文发表在《Food Chemistry: X》。

**主要技术方法**

研究人员使用猪肉里脊（来源：贵州天农兴旺食品有限公司，活重约125 kg，饲养超一年），按4% (w/w)添加不同盐配方（Na100、K40、K25Ca15、Ca40、K25Mg15、Mg40），真空包装后于15?°C、80%相对湿度下发酵40天。采用pH/Aw/水分/盐含量测定评估理化性质；提取并测定组织蛋白酶B/L/D、DPP I/IV、AAP活性；通过蛋白水解指数（PI）、TCA可溶性肽含量和FAAs分析评估蛋白水解程度；利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME/GC-MS）分析VOCs；采用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和Pearson相关性分析解析酶活性与风味物质的关系。

**研究结果**

**3.1 发酵过程中理化性质的变化**：通过测定Aw、水分、pH和盐含量，发现减盐组Aw显著高于全盐对照组（Na100），其中K25Mg15组Aw最高；水分含量整体下降，KCl替代组水分保持较高，而CaCl₂替代组水分最低；pH随发酵时间逐渐降低，CaCl₂替代组pH下降更显著；盐含量在二价盐替代组（Ca40、Mg40）显著低于其他组，表明二价离子渗透较慢。

**3.2 发酵过程中蛋白水解活性动态**：通过酶活性测定，发现组织蛋白酶B和L在整个发酵过程中保持较高活性，且KCl-MgCl₂替代（K25Mg15）显著增强了组织蛋白酶B和L活性（p<0.05），而高浓度Ca²⁺（Ca40）抑制其活性；组织蛋白酶D活性整体下降，所有减盐组均低于Na100组，Ca²⁺抑制最显著；DPP I活性在CaCl₂替代组（K25Ca15、Ca40）显著升高；DPP IV活性在K40和K25Mg15组显著高于Na100组，而在Mg40、K25Ca15、Ca40组显著降低；AAP活性在K25Ca15和Ca40组显著高于Na100组。这表明KCl-MgCl₂主要调节上游和中游蛋白酶（组织蛋白酶和DPP IV），促进多肽向小肽转化；KCl-CaCl₂调节中下游蛋白酶（DPP I和AAP），促进小肽向FAAs转化。

**3.3 发酵过程中蛋白水解变化**：通过PI、TCA可溶性肽和FAAs分析，PI先升后降，第40天K25Mg15组PI最高，反映蛋白降解程度；TCA可溶性肽含量逐渐增加，K25Ca15组在多个时间点显著高于Na100组（p<0.05），表明该组小肽积累更多；总游离氨基酸（TFAAs）含量在发酵40天后显著升高，所有减盐组均高于Na100组，其中Mg40组增幅最大（37.00%），且二价盐替代比例越高，TFAAs含量越高；滋味活性氨基酸（甜、鲜、苦、酸）含量均增加，但Ca40和Mg40组苦味氨基酸升高；TAV分析显示Glu、Leu、Lys、Phe的TAV>1，为主要风味贡献者。

**3.4 酸肉中挥发性化合物变化**：通过HS-SPME/GC-MS鉴定出820种VOCs，包括烃类、酯类、萜烯类、酮类等；PLS-DA模型（R²X=0.972，R²Y=0.997，Q²=0.952）有效区分各组，K25Mg15组与Na100组聚类相似，且总VOCs含量最高；VIP>1的关键化合物包括4-异丙基苯甲醛、2,6-二甲基-4-庚酮、2-辛醇等；K25Mg15组酮类和醇类含量显著高于其他组，K25Ca15组某些酯类（如辛酸乙酯、乳酸乙酯）含量较高。这些结果表明KCl-MgCl₂替代能维持传统风味并增强挥发性风味积累。

**3.5 蛋白酶活性、FAAs和关键风味化合物之间的关系**：通过Pearson相关性分析，发现DPP I与Asp、Phe、Leu、Lys显著正相关（p<0.05），与滋味特征相关；组织蛋白酶与多种十二碳烯烃显著正相关，表明其促进脂质氧化相关VOCs生成；DPP I和AAP与多数VOCs负相关，解释K25Ca15组VOCs含量较低的现象；1-辛烯-3-酮与组织蛋白酶D和DPP IV负相关，2-辛醇与组织蛋白酶B/L正相关等。这些关联证实内源酶活性通过调控蛋白水解和脂质氧化途径影响风味化合物形成。

**讨论与结论**

讨论部分综合分析结果，指出KCl-MgCl₂通过增强组织蛋白酶B/L和DPP IV，促进上游和中游蛋白水解，释放更多氨基酸前体，从而增加酮类、醇类等VOCs含量；KCl-CaCl₂通过增强DPP I和AAP，促进中下游蛋白水解，积累TCA可溶性肽和FAAs，但VOCs总量相对较低，可能因部分前体被用于生成苦味氨基酸或特定的酯类。相关性分析进一步支持了酶活性与风味物质之间的调控关系。研究结论翻译如下：本研究系统评估了在酸肉中用KCl与二价盐（CaCl₂或MgCl₂）协同替代部分NaCl的效果。结果表明，共同替代NaCl与KCl和CaCl₂或MgCl₂有效调节了水分分布（增加Aw、降低水分含量），促进了蛋白降解，并提高了总游离氨基酸（TFAAs）和滋味活性氨基酸的水平，从而改善了酸肉的风味基础。具体而言，KCl-MgCl₂组合显著增强了组织蛋白酶B、组织蛋白酶L和二肽基肽酶IV（DPP IV）的活性，有效增加了挥发性化合物（VOCs）的总含量。相比之下，KCl-CaCl₂组合显著提高了二肽基肽酶I（DPP I）和丙氨酰氨肽酶（AAP）的活性，促进了三氯乙酸（TCA）可溶性肽的积累。基于偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型，鉴定出VIP>1的关键挥发性化合物，如4-异丙基苯甲醛、2,6-二甲基-4-庚酮和2-辛醇，它们是整体风味的主要贡献者。相关性分析进一步揭示了内源蛋白酶活性与某些氨基酸和风味化合物之间的显著关联。总之，KCl与二价盐（CaCl₂或MgCl₂）协同替代NaCl有效调控了蛋白水解和风味形成途径，从而改善了酸肉的综合风味品质。本研究为开发减钠盐配方提供了理论基础，并为推进兼具健康效益和优良感官品质的传统发酵肉制品提供了宝贵见解。