《Food Research International》：Identification and structural characterization of a novel antioxidant tripeptide RGW from Rubing whey and its protective effect against oxidative stress
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•RGW具有很强的DPPH和ABTS+自由基清除能力。•RGW在不同pH值及消化条件下仍保持活性，且溶血性较低。•从红乳中分离出了2316种肽类，其中还有一种新的抗氧化三肽RGW。•RGW能够减少RAW264.7细胞中由H?O?引发的ROS积累。•通过计算分析，MAPK1被认为是
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RGW具有很强的DPPH和ABTS+自由基清除能力。
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RGW在不同pH值及消化条件下仍保持活性，且溶血性较低。
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从红乳中分离出了2316种肽类，其中还有一种新的抗氧化三肽RGW。
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RGW能够减少RAW264.7细胞中由H?O?引发的ROS积累。
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通过计算分析，MAPK1被认为是潜在的信号传导节点。
引言
活性氧是在细胞代谢过程中不断产生的，它在生理状态下参与细胞信号传导和免疫调节（Averill-Bates, 2024）。当活性氧的产生超过细胞内抗氧化系统的调节能力时，氧化还原平衡就会被打破，从而导致脂质、蛋白质和核酸受损，还可能引发炎症反应（Dharshini等，2023）。氧化反应还会影响食品的感官品质、营养成分以及储存稳定性。因此，寻找具有明确结构、稳定活性且安全性良好的天然抗氧化剂，依然是食品功能成分研究中的重要课题。
源自食品的生物活性肽是天然抗氧化剂的重要来源。牛奶蛋白中含有许多具有潜在活性的序列，这些序列在加工或酶解过程中会被释放出来，进而表现出抗氧化、抑制血管紧张素转化酶以及调节免疫的功能（Czelej等，2025；Han等，2026；Jiang等，2025；Kashung & Karuthapandian，2025；X. Li等，2022）。牛奶衍生肽的抗氧化能力与其序列和结构密切相关。肽的长度、分子量、疏水性以及芳香族、碱性及末端氨基酸残基都会影响电子转移、氢原子供给以及自由基清除能力（Rivera-Jiménez等，2022；Wei等，2022）。不过，牛奶衍生肽通常以复杂的混合物形式存在，仅凭混合物的总体活性无法确定其中某一特定序列的作用。虽然数据库筛选可以缩小候选序列的范围，但这些预测仍需通过化学合成的肽类以及体外实验来验证。因此，从复杂的肽谱中筛选出序列明确的候选肽，并验证其抗氧化活性，是识别牛奶衍生抗氧化肽的关键步骤。
红乳是云南地区典型的传统酸凝固山羊乳制品。在加工过程中，酸热凝固作用会促使乳蛋白形成凝块，而未凝固的水溶性蛋白以及低分子量的含氮成分则留在乳清中，这使其成为生物活性肽的潜在来源。目前关于红乳的研究主要集中在加工条件、消化特性以及蛋白质或肽谱的变化方面。已有研究探讨了采用不同酸化处理方式所制得的红乳的体外消化特性和肽谱变化（Wei等，2022）。此外，还有研究在红乳加工副产物乳清的酶解液中发现了降血糖肽，并对其进行了评估（Y. Li等，2023），这进一步表明该乳清具有作为生物活性肽来源的潜力。然而，以往的研究大多集中在红乳产品或外源酶水解得到的乳清上。未经外源酶水解的红乳乳清的低分子量肽组成及其抗氧化活性至今尚未得到充分研究，那些序列明确的候选肽也还需要在加工、消化以及细胞氧化应激条件下进行进一步评估。因此，有必要对红乳乳清中的低分子量肽进行分析，并筛选和验证新的抗氧化肽。
研究人员从云南昆明、大理和西林地区的传统红乳加工过程中收集了等体积的混合乳清样本，通过LC–MS/MS技术对这些样本中的低分子量肽进行了分析。通过生物信息学分析筛选出了候选序列，随后又通过化学合成和体外实验对其抗氧化活性进行了验证。接着，研究人员进一步评估了RGW的自由基清除能力、结构与电子特性、加工及消化稳定性、溶血性，以及其在RAW264.7细胞中对H?O?引发的氧化损伤的防护作用。之后还运用网络药理学、分子对接以及分子动力学模拟技术，预测了RGW与与氧化应激和炎症相关的候选靶点之间的潜在关联和相互作用特征。这项研究旨在为基于红乳乳清开发相关产品提供理论支持。
章节节选
材料与试剂
红乳乳清样本采集自中国云南省的昆明、大理和西林地区。小鼠巨噬细胞RAW264.7购自广州赛科博生物科技有限公司。DPPH、ABTS、胃蛋白酶、胰蛋白酶以及牛血清白蛋白购自上海源恩生物科技有限公司。胎牛血清、青霉素-链霉素混合物以及PBS缓冲液购自大连美伦生物科技有限公司。DMEM培养基则购自
红乳乳清的肽谱特征
来自昆明、大理和西林的红乳乳清样本被等体积混合，这样在候选肽的筛选过程中就能包含来自不同生产地的样本，而不仅仅是单个采样点的样本。通过LC–MS/MS技术，在混合红乳乳清中3?kDa以下的组分里共检测到了2316种肽类（见表S1和图S1）。通过对来源蛋白的分析发现，血清淀粉样蛋白A贡献的肽类数量最多，共有681种肽类，占比为29.40%。β-酪蛋白、αS2-酪蛋白
结论
在云南红乳乳清中3?kDa以下的组分里共鉴定出了2316种肽类。通过生物信息学分析，研究人员发现了一种此前未被报道过的三肽RGW，经过化学合成后其抗氧化活性也得到了证实。RGW对DPPH和ABTS+自由基的清除作用对应的IC??值分别为0.275?mg/mL和18.96?μg/mL。RGW在pH值为3–11的范围内以及经过模拟胃肠道消化后仍保持着较强的自由基清除能力，而在80或100?°C条件下处理则会导致其
CRediT作者贡献说明
周彦正远：撰写——初稿撰写、可视化处理、方法设计、实验研究、正式分析、数据整理、概念构建。石崇英：验证、方法设计、实验研究、正式分析。戴兴英：方法设计、实验研究、正式分析。叶晓琴：方法设计、实验研究、正式分析。张俊雷：撰写——审稿与编辑、监督工作、方法设计。赵存超：监督工作、资源提供。Muhammad Aaqil：资源提供、实验研究。熊思伟：撰写——
资金支持
本研究得到了“高原特色乳制品关键技术的集成创新与产业应用”项目（项目编号FWCY-ZD2024008）以及“云南国际科技合作计划”项目（项目编号202503AK140027）的支持。
未引用参考文献
Li, Wu and Zhao, 2022
Li等，2022
Wang等，2024
Wang等，2024
利益冲突声明
作者声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。
致谢
作者感谢云南省昆明、西林和大理地区的红乳生产者以及样本提供者们在样本收集方面给予的帮助。同时，作者也要感谢那些在LC–MS/MS肽类鉴定及相关数据处理工作中提供支持的技术人员。
伦理审批
所有动物实验均获得了云南农业大学实验室动物伦理委员会的批准（批准编号为202510005），并且实验过程完全符合《实验室动物福利伦理审查指南》（GB/T 35892–2018）的要求。
关于 manuscript 准备过程中生成式AI及AI辅助技术的声明
在准备这篇论文的过程中，作者使用了OpenAI GPT来协助进行英语翻译、语言润色，以及提升文本的清晰度和结构合理性。在使用该工具之后，作者对内容进行了必要的审核、编辑和核实，对最终发表文章的内容负全责。
周彦正远|石崇英|戴兴英|叶晓琴|张俊雷|赵存超|Muhammad Aaqil|熊思伟|魏光强|李玉芳|黄爱祥
