温度与原料对小麦、黑麦及大麦麸质消化性和免疫反应肽的影响

《Food Research International》：Temperature and raw material impact on gluten digestibility and Immunoreactive peptides in wheat, Rye, and barley

　　

温度与原料对小麦、黑麦及大麦麸质消化性和免疫反应肽的影响。采用纳米液相色谱-串联质谱（nanoLC-MS/MS）方法分析麸质消化性和免疫反应肽。研究人员对小麦、黑麦和大麦的酵母发酵面包及酸面团面包进行了模拟消化。通过无标记定量（label-free quantification）分析与小麦相关疾病相关的肽段。与小麦粉相比，大麦粉和黑麦粉的麸质消化性较低。与面包瓤相比，较高温度导致面包皮中麸质消化性较低。

**论文解读：温度与原料对小麦、黑麦及大麦麸质消化性和免疫反应肽的影响**

**一、研究背景与问题**

麸质蛋白（gluten proteins）作为小麦、黑麦和大麦籽粒中的主要贮藏蛋白，可占总籽粒蛋白的80%。根据Osborne分类法，谷物蛋白可分为水溶性清蛋白（albumins）、盐溶性球蛋白（globulins）、醇溶性脯溶蛋白（prolamins）和不可溶谷蛋白（glutelins）。在小麦中，脯溶蛋白和谷蛋白分别被称为麦醇溶蛋白（gliadins）和麦谷蛋白（glutenins），二者共同构成麸质。麸质在面包生产中具有关键的技术功能作用，通过形成粘弹性面团赋予面包良好的气体保留能力。然而，麸质蛋白对特定人群构成健康风险。小麦相关疾病（wheat-related disorders, WRDs）包括乳糜泻（celiac disease, CeD）、小麦过敏（wheat allergy）以及非乳糜泻小麦敏感症（non-celiac wheat sensitivity, NCWS）。CeD是一种炎症性自身免疫性疾病，影响具有遗传易感性的个体，全球患病率为0.7%–2.9%。小麦过敏的全球患病率为0.5%–1%，其症状可表现为胃肠道、皮肤或呼吸道反应。小麦过敏依赖增强因素型（wheat allergy dependent on augmentation factors, WALDA）患者仅在摄入小麦后特定时间内存在额外触发因素（如运动、特定药物或饮酒）时才出现过敏反应。NCWS患病率估计为0.6%–13%，因缺乏特异性生物标志物，只能通过排除其他疾病并观察无麸质饮食改善情况来诊断。

麸质蛋白富含谷氨酰胺和脯氨酸的重复氨基酸序列，这些结构对胃肠消化具有部分抗性，因为脯氨酸会抑制酶切作用。因此，相对较长的肽段未被消化而在小肠中被吸收，其中一些肽段可到达固有层，在WRD个体中引发免疫反应。麸质免疫反应肽（immunoreactive peptides, IPs）已在回肠流出物、粪便和尿液中被检测到，表明部分麸质IPs可转运通过大肠，而另一些则在小肠中被吸收。体外研究表明，麸质肽如著名的33-mer和26-mer对胃肠消化具有抗性。尽管已有研究检测了小麦、黑麦和大麦中的CeD活性基序和过敏原，或在不同烘焙条件下进行了蛋白质组学分析，但现有消化性研究主要集中于提取的麸质或小麦产品。涵盖小麦、黑麦和大麦产品并在肽水平上评估消化性和潜在免疫反应性的综合研究目前尚缺乏。烘焙过程显著影响面包麸质消化性，且较高温度会降低麸质消化性。基于此，该研究旨在提供小麦、黑麦和大麦面粉及相应面包在肽水平上麸质消化性的全面比较，并探究热处理（如烘焙）如何影响体外麸质消化性，同时检测与CeD、小麦过敏和WALDA相关的免疫反应序列。

**二、研究内容与主要结论**

研究人员选取了德国最广泛种植的小麦、黑麦和大麦品种各5个，等量混合后分别制成小麦白面粉（white flour, WF）、小麦全麦粉（whole grain flour, WGF）、黑麦全麦粉和大麦全麦粉。采用标准化INFOGEST 2.0静态体外消化方案对生面粉、酵母发酵面包和酸面团面包的皮与瓤进行模拟消化。通过竞争性酶联免疫吸附试验（ELISA）测定消化物中麸质含量，并利用高分辨率nanoLC-MS/MS进行肽段鉴定与无标记定量（LFQ）。研究构建了人工筛选的WRD蛋白数据库（小麦4024个蛋白，黑麦521个，大麦1096个）和表位数据库（CeD 320个、小麦过敏134个、WALDA 102个表位）。

**三、主要技术方法**

该研究采用了以下关键技术方法：（1）Osborne分级提取结合反相高效液相色谱（RP-HPLC）定量谷物蛋白类型；（2）标准化INFOGEST 2.0静态体外消化模拟胃肠消化过程；（3）竞争性R5抗体ELISA定量消化物中麸质含量；（4）高分辨率nanoLC-MS/MS（Orbitrap Exploris 480质谱仪）进行肽段鉴定；（5）基于自建WRD蛋白数据库和表位数据库的生信分析，通过Python脚本进行肽段匹配、IPs分类及LFQ数据统计。

**四、研究结果**

**4.1 面粉与面包表征**

小麦WF、小麦WGF和黑麦面粉的麸质含量分别为7.3%、6.7%和2.7%，而大麦面粉为4.3%。面包瓤的水分含量（36.8%–43.6%）是相应面包皮（18.7%–24.9%）的两倍。酸面团面包瓤的水分含量高于酵母面包瓤，这与配方差异有关。

**4.2 面粉消化性比较**

**4.2.1 免疫反应肽的鉴定与无标记定量**

小麦WF和WGF消化物中鉴定到相似数量的全部谷物肽（1013和1020个）及IPs（530和526个），其中397个IPs为两者共有，表明面粉类型（白面粉vs全麦粉）对消化产生的肽谱影响较小。相比之下，小麦WGF消化物中鉴定到1103个全部谷物肽，而黑麦和大麦WGF消化物中仅分别鉴定到676和722个。小麦WGF消化物中IPs数量（569个）高于黑麦和大麦（各388个），这直接与小麦中致敏蛋白丰度更高以及小麦蛋白质组数据库覆盖更全面有关。三种谷物消化物间共享肽段极少，表明尽管小麦、黑麦和大麦间序列同源性高，但差异仍足以产生显著不同的IP模式。

**4.2.2 小麦相关疾病背景下的免疫反应肽**

小麦WGF消化物中CeD肽的相对丰度显著高于黑麦WGF消化物，而小麦和大麦消化物中CeD肽丰度几乎相同。三种谷物间小麦过敏肽丰度无显著差异。黑麦WGF消化物中WALDA肽丰度最高，与小麦的差异具有统计学意义。所有三种谷物中，小麦过敏肽相对丰度最低。这表明含麸质谷物的类型显著影响胃肠消化后残留的IP谱。

**4.2.3 麸质消化性**

ELISA结果显示，小麦WF消化物中麸质含量为15.6 mg/L，小麦WGF消化物估计约8 mg/L。在S2组中，大麦WGF消化物麸质含量最高（13.3 mg/L），而小麦和黑麦WGF消化物估计值分别为7和9 mg/L。尽管小麦WGF的麸质含量（6.7%）比大麦（4.3%）高2%以上，但小麦消化物中残留的麸质肽并未更多，表明小麦的消化性更高。nanoLC-MS/MS分析确认，除一个小麦IP（脂质转移蛋白GIHNLNEDNAR）和两个大麦IP外，所有鉴定到的IPs均来源于麸质蛋白。

**4.2.4 肽段序列长度**

小麦WF和WGF消化物的肽段序列长度（sequence length, SeqL）分布非常相似，平均SeqL几乎相同。大麦WGF消化物的平均SeqL最高，而小麦WGF消化物的肽段最短。综合ELISA结果和SeqL评估，大麦的麸质消化性在三者中最低，而小麦的消化性最高。

**4.3 面包皮与面包瓤消化性比较**

**4.3.1 免疫反应肽的鉴定与无标记定量**

在S3-S9样品组中，面包皮消化物中鉴定到的肽段数量均高于面包瓤消化物。黑麦和大麦酵母面包（S5、S6）中皮与瓤之间的差异显著。小麦WGF酸面团面包皮消化物中鉴定到最多IPs（641个），而大麦酵母面包瓤消化物中最少（371个）。多数样品组中，面粉消化物的全部谷物肽和IPs数量介于面包瓤和面包皮之间，表明烘焙可提高面包瓤的谷物蛋白消化性，而面包皮中的较高温度可能降低消化性。

**4.3.2 小麦相关疾病背景下的免疫反应肽**

在小麦和黑麦实验组中，面包皮消化物中CeD肽的相对丰度高于面包瓤和面粉，在S4、S5和S7中差异具有统计学意义。大多数样品组中面包皮消化物的小麦过敏和WALDA肽丰度最高。面包皮消化物中三种WRD肽的相对丰度均较高（S7中CeD肽丰度最高增加32%），与较高的IP相对丰度一致，这可能是面包皮消化性低于面包瓤和面粉的结果。

**4.3.3 麸质消化性**

ELISA分析显示，面包瓤消化物的麸质含量变异较小（14.5–26.3 mg/L），而面包皮消化物变异较大（16.4–45.5 mg/L）。面包皮消化物的麸质含量始终高于对应的面包瓤，表明面包瓤的麸质消化性高于面包皮。nanoLC-MS/MS分析显示，所有样品组中面包皮消化物的相对麸质肽丰度均高于面包瓤，除S9外在所有样品组中差异均具有统计学意义。面包皮消化物中麸质肽的平均和中位数丰度最高，面包瓤最低。较高温度导致面包皮中发生更广泛的heat-induced变化，包括二硫键形成导致的麸质蛋白交联和美拉德反应，这些变化降低了蛋白质溶解度，使酶解更加困难。

**4.3.4 肽段序列长度**

除S9外，所有样品组中面包皮消化物的肽段均较长，S4-S8中差异具有统计学意义。多数样品组中面粉消化物的肽段SeqL介于面包皮和面包瓤之间。这支持了面包瓤的蛋白质消化性高于对应面粉，而面包皮消化性在三种样品中最低的结论。

**五、讨论与结论**

该研究首次对小麦、黑麦和大麦的体外麸质消化性进行了全面的蛋白质组学比较分析。研究证实，当面粉来自同一谷物时，面粉类型（白面粉vs全麦粉）对IP谱和麸质消化性无显著影响。小麦、黑麦和大麦在消化物中产生不同的IP模式。肽段SeqL评估表明大麦的麸质消化性在三种谷物中最低，而小麦被认为是最易消化的谷物，但在消化过程中产生更多且丰度更高的IPs。通过比较面粉、面包皮和面包瓤的消化物，研究发现面包皮的消化性最低，表现为较高的麸质含量、更高的麸质肽丰度和更长的肽段。烘焙改善了面包瓤相对于面粉的麸质消化性，但面包皮中达到的较高温度对麸质消化性产生负面影响。面包皮较低的麸质消化性导致更多数量和更高丰度的IPs。该研究有助于更好地理解WRDs背景下的麸质消化性以及潜在酶添加剂的需求，从而改善免疫反应序列的消化。未来研究应探索不同烘焙温度、不同面包配方和原料的影响，并通过临床研究在体内验证这些发现。