《Frontiers in Neuroendocrinology》：Freezing as a measure of fear: sex differences and implications for preclinical research
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啮齿动物恐惧条件化范式被广泛用于模拟创伤后应激障碍(PTSD)的核心特征，其中冻结行为作为主要读数。然而，冻结行为在多大程度上捕捉到了生物学和临床相关的变异，特别是关于性别差异，仍不清楚。研究人员对使用野生型啮齿动物进行恐惧条件化和消退的研究进行了系统综述和荟
啮齿动物恐惧条件化范式被广泛用于模拟创伤后应激障碍(PTSD)的核心特征，其中冻结行为作为主要读数。然而，冻结行为在多大程度上捕捉到了生物学和临床相关的变异，特别是关于性别差异，仍不清楚。研究人员对使用野生型啮齿动物进行恐惧条件化和消退的研究进行了系统综述和荟萃分析，以评估冻结行为中的性别差异。这些差异在研究中未被发现。然而，冻结水平仅与雄性啮齿动物的电击强度显著相关。研究人员得出结论，冻结可能代表一种受限且可能低分辨率的行為输出，可能无法检测到恐惧处理中有意义的变异。鉴于PTSD在人类中表现出显著的性别差异，常用行为终点的转化效度可能值得怀疑。在动物模型中包括两性并完善行为读数对于改善压力研究的转化管道至关重要。
1. Introduction
创伤后应激障碍（PTSD）是一种以恐惧相关过程失调为核心特征的衰弱性精神疾病，其症状包括创伤的侵入性再体验、对创伤相关线索的持续回避、认知和情绪的负面改变，以及过度警觉和反应性增强。情境恐惧条件化范式通过探查恐惧学习、消退和情境辨别，具有转化相关性。啮齿动物恐惧条件化实验被广泛用于剖析PTSD相关神经回路，并推动了临床前药理学研究，如血清素能抗抑郁药和谷氨酸能机制（如氯胺酮，ketamine）的探索。性别作为关键生物学变量日益受到重视，临床数据显示女性PTSD患病率是男性的2-3倍，且症状表现不同。然而，临床前研究过度依赖雄性动物。冻结行为（freezing），定义为除呼吸外无动作，作为标准读数已有60年历史，其有效性得到多项研究支持，但可能限制解读，忽略主动防御行为。雌性可能表现出更多的主动响应（如冲刺，darting）。本研究旨在系统评估雄性和雌性啮齿动物在恐惧消退和泛化范式中的冻结反应，重点分析性别偏倚、行为结果差异、性别选择理由，以及电击强度与冻结的关系。
2. Methods
2.1 Eligibility criteria
纳入标准包括：使用啮齿动物（小鼠或大鼠）的原始研究，采用情境恐惧条件化范式，并提供足够实验细节。排除标准包括：仅人类研究、仅线索恐惧条件化、缺乏原始数据、以及将恐惧测量为不动性（immobility）而非冻结。
2.2 Study selection process
两个独立文献搜索分别针对消退范式（2000-2025年，Google Scholar和PubMed）和辨别/泛化范式（2010-2025年，PubMed和Web of Science）。消退研究共803篇，最终纳入219篇；辨别研究共1007篇，纳入150篇。
2.3 Information extraction
提取书目细节、样本特征（物种、品系、年龄、性别）、行为协议（电击强度、持续时间、试验次数）、脑区关注点、影响因子、性别分离及其理由等。计算总电击量（TS）为电击强度×持续时间×次数。
2.4 Meta-analysis methodology
选择标准化的恐惧条件参数（电击强度0.5-1.5 mA，持续1-3秒，最多5次）以减小异质性。使用随机效应模型，进行调节变量元回归，包括物种、电击强度、次数、结果测量和偏倚风险评分。
2.5 Risk of bias
使用SYRCLE偏倚风险工具评估10个领域，包括序列生成、基线特征、分配隐藏、随机饲养、人员盲法、随机结果评估、结果评估者盲法、不完整数据、选择性报告和其他偏倚。
2.6 Data extraction
提取雄性和雌性啮齿动物的冷冻水平数据，计算标准化均值差（SMD）。仅提取阴性对照组（如野生型）的数据，且选择协议中产生最高冷冻水平的条件。
2.7 Statistics
使用R 4.3.0和4.5.0，meta包进行荟萃分析，异质性用I2和τ2评估，Cochran's Q检验亚组差异。计算辨别指数（DI）为（电击情境冷冻-中性情境冷冻）/（电击情境冷冻+中性情境冷冻）。相关性分析采用Spearman检验，并通过回归诊断识别影响点。
3. Results
3.1 Sex bias in rodent models
在消退研究中，小鼠研究72%仅用雄性，1%仅用雌性，20%两性，7%未报告；大鼠研究87%仅用雄性，4%仅用雌性，8%两性。在辨别研究中，小鼠研究62%仅用雄性，4%仅用雌性，26%两性；大鼠研究83%仅用雄性，无雌性单独研究，15%两性。表明存在强烈且一致的雄性偏倚。
3.2 Meta-analyses of freezing response
消退训练开始时和结束时，冷冻水平均存在高异质性（I2>96%），但未发现性别差异（X2检验p>0.5）。标准化均值差（SMD）分析也未显示性别调节效应。消退过程中冷冻显著降低（MD=37.27%），但性别间无差异。辨别任务中，在电击情境下，雄性冷冻水平显著高于雌性（SMD=0.63, p=0.038），中性情境中无差异。辨别指数无性别差异。
3.3 Insufficient justification for sex selection
在消退研究中，仅6%的雄性小鼠研究和5%的雄性大鼠研究提供了理由；而包含雌性的研究中，50%以上提供了理由。常见理由包括避免雌性激素变异或强调女性临床高发病率。在辨别研究中，雄性小鼠仅5%提供理由，雄性大鼠88%未提供理由；包含雌性的研究更可能提供理由。
3.4 Freezing levels and shock amount
在消退研究中，总电击量（TS）与冷冻水平仅在雄性中呈正相关（Spearman's ρ=0.192, p=0.014），在雌性中不显著。在辨别研究中，电击情境下TS与冷冻水平仅在雄性中正相关（ρ=0.352, p=0.0002），中性情境中无相关性。年龄与冷冻水平无显著相关。
4. Discussion
本综述揭示了啮齿动物情境恐惧研究中显著的雄性偏倚，尽管存在已知的人类性别差异。荟萃分析未发现消退范式中冷冻的性别差异，但辨别范式中在电击情境下出现微弱雄性优势。性别选择理由的报道不对称，雄性使用常被视为默认。冷冻与电击强度的关系仅在雄性中显著，表明雌性可能采用不同的防御策略。机制上，可能与促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）和蓝斑-去甲肾上腺素（LC-NE）系统的性别二态性有关，雌性可能更倾向于活跃防御，如冲刺，导致冷冻测量低估其恐惧表达。
5. Conclusion
本研究发现压力负荷依赖的性别差异，雌性在强厌恶性刺激下可能不增加冷冻，而转向主动防御。仅依赖冷冻测量可能低估雌性的恐惧，并限制转化效度。未来研究应纳入多维度行为评估，包括主动防御行为，并系统纳入两性。
6. Limitations
本综述仅关注情境恐惧条件化，结果不能推广至其他范式。研究间异质性高，部分由于检测方法不同。年龄信息不完整，多数研究使用年轻成年动物，限制了年龄效应的结论。缺乏足够的两性研究以进行物种特异性分析，反映了历史偏倚和报道缺口。
7. Definition of sex
本文中“sex”指一组生物属性，包括染色体基因型、激素水平、内外解剖结构，采用出生时指定的二元分类（男性/女性）。
