LncRNA HOTAIR/miR-9-5p/FOXP1 轴通过 NLRP3 炎症小体激活调节脑缺血再灌注损伤

《IBRO Neuroscience Reports》：LncRNA HOTAIR/miR-9-5p/FOXP1 Axis Modulates Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury via NLRP3 Inflammasome Activation

　　

摘要目的：本研究旨在探讨HOTAIR-miR-9-5p轴与缺血性脑卒中（IS）中炎症反应之间的关联，并阐明其潜在分子机制。方法：采用大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）和氧糖剥夺/复氧（OGD/R）在体内和体外模拟缺血/再灌注条件。通过qRT-PCR评估患者血清或MCAO/R小鼠脑组织中HOTAIR和miR-9-5p的表达水平，并通过ELISA分析IL-1β和IL-18的分泌水平。采用双荧光素酶报告基因实验、RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）和RNA pull-down实验验证靶向关系。应用Western blotting评估NLRP3、CASP1和FOXP1的表达。此外，通过脑室内注射antagomir-9-5p的MCAO/R小鼠来评估antagomir-9-5p对脑缺血再灌注损伤（CIRI）的影响。结果：在IS患者和MCAO/R小鼠中，均观察到HOTAIR-miR-9-5p轴与炎症之间存在显著关联。在IS患者血清、MCAO/R小鼠脑组织以及SH-SY5Y细胞中，HOTAIR异常低表达，而miR-9-5p和相关的NLRP3炎症反应蛋白水平升高。机制上，miR-9-5p负调控HOTAIR和FOXP1的表达。此外，发现HOTAIR通过miR-9-5p/FOXP1通路调节NLRP3表达。功能实验表明，沉默miR-9-5p可保护脑缺血/再灌注损伤并抑制NLRP3炎症小体激活。结论：这些发现共同证明HOTAIR/miR-9-5p/FOXP1轴在IS后NLRP3炎症小体激活中发挥关键作用，提示其阻断可能成为缺血性脑损伤的潜在治疗策略。

**论文解读：HOTAIR/miR-9-5p/FOXP1轴通过NLRP3炎症小体激活调节脑缺血再灌注损伤**

**研究背景、问题与意义**

脑卒中是导致死亡和永久性残疾的主要原因之一，其中缺血性脑卒中（IS）约占85%。目前，血管内取栓或药物溶栓是急性缺血性脑卒中的有效治疗手段，但再灌注可能引发脑缺血再灌注损伤（CIRI），进一步加重神经损伤。CIRI涉及缺氧、氧化应激和炎症反应，导致坏死、凋亡和自噬。NLRP3炎症小体激活在IS病理过程中发挥关键作用，其驱动caspase-1介导的IL-1β和IL-18成熟与释放，加剧神经炎症和继发性脑损伤。然而，调控NLRP3炎症小体激活的分子机制尚不完全清楚。长链非编码RNA（lncRNA）HOTAIR在多种癌症中被鉴定为潜在治疗靶点，但其在IS中对NLRP3炎症小体的作用及机制尚未阐明。同时，miR-9-5p在IS中水平升高，但参与NLRP3激活的机制未知。因此，研究人员开展本研究，旨在阐明HOTAIR/miR-9-5p/FOXP1轴在IS发展中的作用，并验证抑制miR-9-5p能否通过该轴抑制NLRP3炎症小体激活，从而为CIRI提供新的治疗策略。该论文发表在《IBRO Neuroscience Reports》。

**主要关键技术方法**

研究人员从临沂市人民医院招募了24例急性缺血性脑卒中（AIS）患者和24例健康对照，采集血清样本。体内实验采用雄性C57BL/6小鼠（42只）建立大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）模型，并通过脑室内注射antagomir-9-5p进行干预。体外实验采用人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y构建氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型。主要技术方法包括：qRT-PCR检测RNA表达；ELISA检测细胞因子水平；双荧光素酶报告基因实验、RNA免疫沉淀（RIP）和RNA pull-down实验验证靶向结合；Western blotting检测蛋白表达；TTC染色评估梗死体积；改良神经功能缺损评分（mNSS）评估神经功能。

**研究结果**

**3.1 临床样本中HOTAIR-miR-9-5p轴与炎症反应的关联**：通过qRT-PCR检测发现，与健康对照组相比，IS患者血清中HOTAIR表达降低，而miR-9-5p表达升高，二者呈负相关。ELISA显示IS患者血清IL-1β和IL-18水平升高，且与HOTAIR负相关，与miR-9-5p正相关。

**3.2 MCAO/R小鼠模型中HOTAIR-miR-9-5p轴与炎症反应的关联**：在MCAO/R小鼠脑组织中，HOTAIR在再灌注后6、24、72小时表达降低，miR-9-5p升高，二者呈负相关。ELISA显示IL-1β和IL-18在再灌注24和72小时显著升高，且与miR-9-5p正相关，与HOTAIR负相关。

**3.3 MCAO/R小鼠脑内炎症反应增强及FOXP1表达下调**：qRT-PCR和Western blotting显示MCAO/R小鼠脑组织中NLRP3和CASP1的mRNA和蛋白水平升高，而FOXP1表达降低。在SH-SY5Y细胞中过表达FOXP1可抑制NLRP3表达。

**3.4 miR-9-5p负调控HOTAIR和FOXP1的表达**：双荧光素酶报告基因实验证实miR-9-5p直接靶向HOTAIR和FOXP1的3'UTR。qRT-PCR显示miR-9-5p mimic降低HOTAIR和FOXP1表达，而inhibitor则升高。Western blotting显示miR-9-5p下调FOXP1蛋白，而HOTAIR上调FOXP1，且该效应可被miR-9-5p逆转。RIP实验证实HOTAIR、miR-9-5p和FOXP1富集于Ago2抗体。RNA pull-down实验证实miR-9-5p直接与HOTAIR和FOXP1结合。

**3.5 HOTAIR通过miR-9/FOXP1通路调节NLRP3表达**：在OGD/R处理的SH-SY5Y细胞中，HOTAIR表达降低，miR-9-5p升高，NLRP3、CASP1、IL-1β和IL-18表达升高。过表达HOTAIR可降低NLRP3和CASP1表达，而miR-9-5p inhibitor可逆转该效应。抑制miR-9-5p通过上调FOXP1降低NLRP3表达，而FOXP1敲低可逆转该效应。HOTAIR过表达通过上调FOXP1抑制NLRP3。

**3.6 沉默miR-9-5p保护脑缺血/再灌注损伤并抑制NLRP3炎症小体激活**：在MCAO/R小鼠中，脑室内注射antagomir-9-5p可降低梗死体积和神经功能缺损评分。qRT-PCR显示antagomir-9-5p上调HOTAIR和FOXP1，下调miR-9-5p。ELISA和Western blotting显示antagomir-9-5p降低IL-1β、IL-18、NLRP3和CASP1的表达。

**讨论与结论**

讨论部分指出，CIRI在临床中常见且缺乏特异性治疗。HOTAIR和miR-9-5p在IS患者和模型中的表达模式提示其可能作为诊断标志物。NLRP3炎症小体是IS治疗的重要靶点。本研究首次揭示HOTAIR作为竞争性内源RNA（ceRNA）海绵吸附miR-9-5p，上调FOXP1，从而抑制NLRP3炎症小体激活。研究局限性包括临床样本量小、机制需进一步探索以及SH-SY5Y细胞模型的局限性。结论翻译：总之，本研究揭示了差异表达的lncRNA HOTAIR通过miR-9/FOXP1轴作为ceRNA调节缺血性脑卒中中的NLRP3炎症反应。此外，抑制miR-9-5p可通过减轻MCAO小鼠的NLRP3炎症反应减少梗死体积，为非编码RNA在缺血性脑卒中诊断和治疗中的应用提供了理论基础。